【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学，特别涉及一种安眠酮半抗原、完全抗原的制备方法。
技术介绍
1、安眠酮，又名海米那，属于非巴比妥类中枢神经镇定药。临床上常用作催眠药、镇定药，主要用于动物过度兴奋或惊厥，可使机体平静；但该药副作用较大，进入人体后会表现出恶心、呕吐、头晕、无力、四肢及口舌麻木，个别较重患者会有短时间的精神失常。但长期服用可产生耐受性及成瘾性。安眠酮属于中枢神经的安定药类，是受国家管制的精神药品，但是由于利益驱使还是会被非法添加使用。
2、
3、目前较广泛使用的方法是高效液相色谱法、气相色谱法、气质联用，高效毛细管电泳法和免疫分析法等，hplc和gc-ms等色谱法的灵敏度较其它方法较高，但需要昂贵的仪器、设备和经过专门培训的技术人员，不适于批量样品的筛选检测和现场即时检测。通常情况这些理化分析方法样本前处理过程相当复杂，效率比较低下，分析成本较高，主要针对法医对中毒的鉴定。这些方法对出现动物可食组织中的安眠酮残留问题不能做出迅速反应，也不适合作为安眠酮在可食动物组织中残留的初筛方法。
4、针对目前我国对食品安全要求越来越严格的趋势，建立灵敏度高，特异性强，简便易行的动物源性食品中安眠酮残留量的测定方法，为加强食品的贸易进出口把关意义重大。免疫检测法弥补了理化检测方法的缺憾，它最突出的优点是取样量少、前处理简单、容量大、仪器化程度低、灵敏度高，分析效率可达色谱分析方法的几十倍，适用于大批量样本安眠酮残留的快速筛选性检测。它可以同时测定大批量样品，用于大批量检测的初筛；投资少而且操作简便，适合基
5、在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测安眠酮残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，但现有技术无法实现，而本申请采用全合成方法合成新的安眠酮半抗原，与文献报道的结构不同的是，本专利技术的安眠酮半抗原，其活性位点在另一个苯环上，更能突出安眠酮的特征性结构，做出来的抗体，灵敏度会更高。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种安眠酮半抗原、完全抗原的制备方法，可以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种安眠酮半抗原的制备方法，包括如下合成步骤：
3、s1：以2-氨基-4-硝基苯甲酸为起始原料，先和醋酐反应，生成2-乙酰氨基-4-硝基苯甲酸；
4、s2：将s1中的反应物与邻甲苯胺进行缩合，生成带有一个硝基基团的安眠酮结构；
5、s3：将硝基还原成氨基，利用芳胺的重氮化反应，以此来偶联大分子蛋白；
6、通过上述s1-s3得到如下安眠酮半抗原：
7、
8、进一步的，半抗原合成路径如下：
9、
10、进一步的，s1中取2-氨基-4-硝基苯甲酸，用乙腈溶解，然后加入吡啶，磁力搅拌下逐滴加入醋酐，升温至60℃反应6～8小时，降至室温，加入冰水，用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干乙酸乙酯，得第一步产物；
11、s2中将第一步产物和邻甲苯胺装入容积为三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入甲苯，再慢慢加入三氯化磷，滴加完后，升温回流反应4小时，反应结束后，将冷水加入反应体系，并用2m naoh溶液中和至碱性，静置1h后分离并保留苯层，再用甲苯萃取水层，合并萃取液，有机相经水洗后用无水硫酸钠脱水干燥以除去多余的水分，有机相减压蒸馏去除甲苯，得到的粗品再用硅胶柱层析纯化后得到第二步产物；
12、s3中取第二步产物加入乙酸乙酯进行溶解，加入pd-c，用装满氢气的气球套在三通阀上，置换反应瓶内的气体3次以上，气球加氢条件下搅拌反应2个小时。反应完毕，过滤掉钯碳，旋干乙酸乙酯，加入稀盐酸溶，加入适量活性炭，搅拌条件下加热到80度，保温30分钟，趁热过滤，析出固体，固体烘干即得目标半抗原。
13、进一步的，利用安眠酮半抗原制备完全抗原的制备方法，包括如下步骤
14、s01：先通过安眠酮半抗原的制备方法合成所述半抗原；
15、s02：然后将所述半抗原活化；
16、s03：再与所述载体蛋白进行偶联，得到所述的安眠酮完全抗原；
17、通过上述s01-s03得到如下安眠酮完全抗原：
18、
19、进一步的，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。
20、进一步的，利用安眠酮半抗原制备人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
21、s011：合成安眠酮半抗原；
22、s012：合成半抗原重氮盐，在棕色瓶中，取半抗原加入纯水中，加入盐酸溶液，搅拌溶解后降温至4度左右，快速加入亚硝酸钠，保持低温反应30分钟，反应完毕，加入尿素，形成的重氮盐置于低温留待备用；
23、s013：合成人工抗原，取半抗原重氮盐加入到溶有血蓝蛋白的pbs溶液中，溶液的ph值始终保持在7-8之间于4度条件下反应过夜，然后将反应液装入透析袋，用溶液充分透析，得到人工抗原。
24、进一步的，s013人工抗原--免疫原的制备是取半抗原重氮盐5mg，加入到溶有5mg血蓝蛋白的pbs溶液中，溶液的ph值始终保持在7-8之间于4度条件下反应过夜；然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/l pbs溶液充分透析，得到人工抗原--免疫原。
25、进一步的，s013人工抗原--包被原的制备是取半抗原重氮盐20mg，加入到溶有100mgbsa的pbs溶液中，溶液的ph值始终保持在7-8之间于4度条件下反应过夜；然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/l pbs溶液充分透析，得到人工抗原--包被原。
26、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
27、1、本专利技术与现有的安眠酮半抗原、完全抗原的制备方法不同的是，衍生出的活性位点在稠环上的苯环一侧，不但最大程度保留了安眠酮的特征结构，且更能突出邻甲苯的结构，使得安眠酮半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体发生偶联的氨基；安眠酮半抗原与载体偶联后得到的安眠酮人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立安眠酮的各种免疫分析方法提供基础。
28、2、本专利技术中安眠酮半抗原的合成方法，仅有3步，与一些5-6步的合成方法相比，一是步骤简单，二是原料易得，三是反应操作较为简单，反应条件易于控制，本专利技术的安眠酮半抗原合成方法简单有效，比其它方法更具优势
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1.一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下合成步骤：
2.如权利要求1所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，半抗原合成路径如下：
3.如权利要求1所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，S1中取2-氨基-4-硝基苯甲酸，用乙腈溶解，然后加入吡啶，磁力搅拌下逐滴加入醋酐，升温至60℃反应6～8小时，降至室温，加入冰水，用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干乙酸乙酯，得第一步产物。
4.如权利要求3所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，S2中将第一步产物和邻甲苯胺装入容积为三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入甲苯，再慢慢加入三氯化磷，滴加完后，升温回流反应4小时，反应结束后，将冷水加入反应体系，并用2M NaOH溶液中和至碱性，静置1h后分离并保留苯层，再用甲苯萃取水层，合并萃取液，有机相经水洗后用无水硫酸钠脱水干燥以除去多余的水分，有机相减压蒸馏去除甲苯，得到的粗品再用硅胶柱层析纯化后得到第二步产物。
5.如权利要求4所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，S3中取第二步产物加
6.如权利要求5所述的利用安眠酮半抗原制备完全抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
7.如权利要求3所述的利用安眠酮半抗原制备完全抗原的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。
8.如权利要求5所述的利用安眠酮半抗原制备人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.如权利要求8所述的利用安眠酮半抗原制备人工抗原的制备方法，其特征在于，S013人工抗原--免疫原的制备是取半抗原重氮盐5mg，加入到溶有5mg血蓝蛋白的PBS溶液中，溶液的pH值始终保持在7-8之间于4度条件下反应过夜；然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/L PBS溶液充分透析，得到人工抗原--免疫原。
10.如权利要求8所述的利用安眠酮半抗原制备人工抗原的制备方法，其特征在于，S013人工抗原--包被原的制备是取半抗原重氮盐20mg，加入到溶有100mgBSA的PBS溶液中，溶液的pH值始终保持在7-8之间于4度条件下反应过夜；然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/L PBS溶液充分透析，得到人工抗原--包被原。
...【技术特征摘要】
1.一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下合成步骤：
2.如权利要求1所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，半抗原合成路径如下：
3.如权利要求1所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，s1中取2-氨基-4-硝基苯甲酸，用乙腈溶解，然后加入吡啶，磁力搅拌下逐滴加入醋酐，升温至60℃反应6～8小时，降至室温，加入冰水，用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干乙酸乙酯，得第一步产物。
4.如权利要求3所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，s2中将第一步产物和邻甲苯胺装入容积为三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入甲苯，再慢慢加入三氯化磷，滴加完后，升温回流反应4小时，反应结束后，将冷水加入反应体系，并用2m naoh溶液中和至碱性，静置1h后分离并保留苯层，再用甲苯萃取水层，合并萃取液，有机相经水洗后用无水硫酸钠脱水干燥以除去多余的水分，有机相减压蒸馏去除甲苯，得到的粗品再用硅胶柱层析纯化后得到第二步产物。
5.如权利要求4所述的一种安眠酮半抗原的制备方法，其特征在于，s3中取第二步产物加入乙酸乙酯进行溶解，加入pd-c，用装满氢气的气球套在三通阀上，置换反应瓶内的气体3次以上，气球加氢条件下搅拌反应2个小时，反应完毕，过滤掉钯碳，旋干乙酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈彤，蒋永青，钟名琴，朱永利，吴雯娟，
申请(专利权)人：深圳市质量安全检验检测研究院深圳市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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