【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵法制备酶的工艺，具体涉及一种微生物发酵发制备碱性过氧化氢酶的方法。
技术介绍
1、过氧化氢酶(cat)，是一种可以将h2o2进行催化生成水和氧气的酶，一般存在于动植物细胞中的过氧化物酶体内，并且过氧化物酶体的标志酶就是过氧化氢酶。
2、过氧化氢酶的应用非常广泛。(1)医药：由于h2o2具有杀菌，清洁，漂白以及消毒的功效，因此常用于仪器消毒。如果在隐形眼镜消毒期间中添加cat消毒剂中的h2o2可被分解。(2)食品加工：过氧化氢酶可以使食品保鲜，并作为抗氧化剂消除啤酒，饮料中分子氧，活性氧和自由基。它用作氧气与葡萄糖氧化酶的去除剂，牛乳杀菌和奶酪原料乳的杀菌。(3)环保：在大部分发达国家中过氧化氢一般都用在环保行业，这一比重占到了大约十分之一到五分之一。用过氧化氢酶环保的原因是因为其能代替其他的有污染性的化学试剂，而这些能降解过氧化氢的化学试剂一般都具有二次污染性，而过氧化氢酶是没有的，并且过氧化氢酶还能有其他的作用，在对芳香族环状化合物与脂肪族化合物时都具有降解作用。着名的环保过氧化氢酶是辣根过氧化物酶。(4)纺织：纺织行业里应为需要印染，所以去除过氧化氢是一个必须的步骤，传统的去除手法有两个不同的版本，一个是用过氧化氢漂白后用冷热水交替清洗干净把过氧化氢除去；第二个就是用过氧化物还原剂，然后在清洗，然后进行染色步骤。相比于传统的工艺，过氧化物漂白的优势就体现出来了，用过氧化氢酶去除过氧化氢的话不仅方便快捷而且只需一次或者不需要清洗就能直接染色。过氧化氢酶环保节省、消耗作业时间短、作业环境安全、
3、过氧化氢酶的生产主要来源还是从动物肝脏中进行提取，但是这种生产过氧化氢酶的工艺容易受到原料供应的限制，成本非常高，而通过微生物发酵法生产过氧化氢酶成本很低，而且原料也容易获取，所以市场上的绝大部分过氧化氢酶都是通过微生物发酵法来生产；不仅碳源，氮源，无机盐，生长因子(烟酸)等营养成份对微生物发酵生产过氧化氢酶的过程影响很大，微生物分泌生产过氧化氢酶的过程也收到各种发酵条件限制，所以说要提高微生物发酵生产的过氧化氢酶的量和酶的比活，也需要对微生物的发酵条件进行优化。
4、正因为过氧化氢酶有着如此广泛的应用，有着重要工业价值，而现在各国科研工作者进行的过氧化氢酶生产工艺方法各有不同，而通过对过氧化氢酶微生物发酵条件的优化，以提高菌种所产过氧化氢酶的量和比活，是一条十分重要的技术路线。在这样的背景条件下，我们研发了一种通过微生物发酵法生产制备碱性过氧化氢酶的新工艺。
技术实现思路
1、为了进一步提高所生产过氧化氢酶的效率，本专利技术提供了一种微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法。
2、本专利技术涉及的生产菌株为节杆菌arthrobacter sp.，保藏编号为cgmccno.8181，已在中国专利公开号cn103555620a公开。
3、本专利技术提供了一种通过微生物发酵法生产制备碱性过氧化氢酶的新工艺，具体的碱性过氧化氢酶发酵生产工艺步骤为：
4、以节杆菌arthrobacter sp.(保藏编号为cgmcc no.8181)为生产菌株，对生产菌株的培养，所述生产菌株的培养包括对菌株固态和液态培养基的制备，固态培养基能够高效制备菌体细胞，在固体培养基各组成成份的基础上，进一步获得用于发酵生产的液态种子培养基。
5、碱性过氧化氢酶发酵过程的优化，所述碱性过氧化氢酶发酵过程的优化具体包括通过向发酵罐中添加特定的碳源，氮源，无机盐，生长因子(烟酸)营养物质，实验数据显示这些措施显著提高菌株所产碱性过氧化氢酶的量和酶的比活。
6、本专利技术所使用的固体培养基的组成为：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，氯化钠2.5g/l，琼脂25g/l，硝酸钠2.5g/l，葡萄糖20g/l。其具体的制备工艺为：a组营养成份的制备过程：将下列组分依次加入到1000ml的水中：10g酵母提取物，20g蛋白胨，2.5g氯化钠，25g琼脂，然后充分混匀，122.5℃灭菌20分钟；b组营养成份：将2.5g硝酸钠和20g葡萄糖单独进行灭菌122.5℃灭菌20分钟；在超净工作台上，将灭菌后的b组营养物质加入a组营养成份。灭菌过程结束后，自然冷却备用。
7、固体培养基用于生产菌株的选育。具体地，将活化后的原始出发菌株接入已充分进行蒸汽杀菌并冷却的菌种培养基中，在30℃-37℃温度条件下进行培养24小时，在这一阶段选育获得能够作为发酵产生过氧化氢酶的生产菌株的单菌落。
8、本专利技术所使用的种子培养基其组成与固体培养基的区别是不含琼脂，其具体组成为：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，氯化钠2.5g/l，硝酸钠2.5g/l，葡萄糖20g/l。种子培养基用于扩大培养一级种子和二级种子。
9、一级种子具体的制备工艺过程为：用接种针挑一环已经在固体培养基完成培养的菌体细胞，随后接入含有50ml种子培养基的容量为250ml的广口三角摇瓶中，最后将摇瓶固定在bs-2f振荡培养箱中，在30℃-37℃温度条件下对摇瓶中的碱性过氧化氢酶生产菌株进行震荡培养，震荡培养可以使得菌种与培养基混合充分，使得每一个菌体细胞都能得到充分滋养，在这一阶段最终可以获得用于发酵的一级种子。
10、优选地，一级种子具体的制备工艺条件为：在200-250rpm，在30℃-37℃温度条件下培养8h-12h，培养基的ph值为7.8。当一级种子的菌体培养液浓度od600值达到0.9-1.5，菌体培养液ph值在7.0-8.1之间时，转接培养二级种子。
11、二级种子具体的制备工艺过程为：将一级种子按照2.0％-4.0％的接种量进行转接，将一级种子在无菌操作条件下转接入含有种子培养基的发酵罐中，菌种细胞在发酵罐扩大培养二级种子。
12、发酵生产碱性过氧化氢酶的具体工艺工程：当二级种子菌体细胞达到一定浓度时(即培养液菌体浓度od600值达到1.6-2.2)，将一定量的碳源，氮源，无机盐，生长因子(烟酸)按照一定顺序添加到发酵罐中，在充分搅拌混匀最后形成用于生产碱性过氧化氢酶的发酵培养基，培养基的ph值为7.8，菌种细胞在发酵罐中发酵生产碱性过氧化氢酶。控制发酵罐内的发酵温度，发酵罐的温度设置为30℃-37℃，转速200-250rpm条件下连续发酵36-68h。
13、具体的，在发酵罐中加入碳源30-45g/l、氮源15-60g/l、无机盐0.5-0.6g/l和生长因子0.02-0.35g/l，；其中，氮源由豆柏和硝酸钠按质量比3:1组成。
14、在本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括具体步骤如下：以节杆菌Arthrobacter sp.CGMCC NO.8181为生产菌株，将生产菌株活化后，在种子培养基进行培养，获得一级种子；将一级种子按照2.0％-4.0％的接种量在无菌操作条件下接种至含有种子培养基的发酵罐中扩大培养，菌体培养液OD600值达1.6-2.2，在发酵罐中加入碳源30-45g/L、氮源15-60g/L、无机盐0.5-0.6g/L和生长因子0.02-0.35g/L，菌种细胞在发酵罐中发酵生产碱性过氧化氢酶；其中，氮源由豆柏和硝酸钠按质量比3:1组成。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述碳源包括蔗糖、可溶性淀粉、木薯淀粉中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述无机盐包括氯化钠、磷酸二氢钾中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述碳源为木薯淀粉，其加入量为45g/L；所述氮源加入量为60g/L；所述无机
5.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的组成为：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，氯化钠2.5g/L，硝酸钠2.5g/L，葡萄糖20g/L。
6.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，一级种子的具体培养过程：用接种针挑一环活化的菌体细胞，接入含有50ml种子培养基的容量为250ml的广口三角摇瓶中，在30℃-37℃温度条件下对摇瓶中的碱性过氧化氢酶生产菌株进行震荡培养。
7.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述一级种子的菌体培养液浓度OD600值达到0.9-1.5，菌体培养液pH值在7.0-8.1之间。
8.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，发酵生产碱性过氧化氢酶，控制发酵罐内的发酵温度为30℃-37℃，转速200-250rpm条件下连续发酵36-68h。
9.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述制备方法还包括，在发酵罐结束发酵之后，取发酵液在10800×g的条件下，进行离心，所获得的菌泥用50mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH值为7.0)洗涤，再以缓冲液进行重悬，然后将其置于冰水中进行预冷，用超声波破碎仪进行破碎，12700×g的条件下离心，取上清液，上清液即为碱性过氧化氢酶粗酶液。
...【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括具体步骤如下：以节杆菌arthrobacter sp.cgmcc no.8181为生产菌株，将生产菌株活化后，在种子培养基进行培养，获得一级种子；将一级种子按照2.0％-4.0％的接种量在无菌操作条件下接种至含有种子培养基的发酵罐中扩大培养，菌体培养液od600值达1.6-2.2，在发酵罐中加入碳源30-45g/l、氮源15-60g/l、无机盐0.5-0.6g/l和生长因子0.02-0.35g/l，菌种细胞在发酵罐中发酵生产碱性过氧化氢酶；其中，氮源由豆柏和硝酸钠按质量比3:1组成。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述碳源包括蔗糖、可溶性淀粉、木薯淀粉中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述无机盐包括氯化钠、磷酸二氢钾中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述碳源为木薯淀粉，其加入量为45g/l；所述氮源加入量为60g/l；所述无机盐为磷酸二氢钾，其加入量为0.5g/l；所述生长因子为烟酸，其加入量为0.35g/l。
5.根据权利要求1所述的微生物发酵法制备碱性过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述种子培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘焕民，田昌盛，张峰，宋勇，汪嘉峻，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：
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