【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，本专利技术涉及靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体及其应用。
技术介绍
1、铜绿假单胞菌是一种临床上重要的机会性革兰氏阴性致病菌，可导致多种严重的感染病，如术后伤口感染、褥疮、脓肿、化脓性中耳炎，甚至发生菌血症和败血症造成死亡。它主要影响免疫受损的患者，特别是囊性纤维化患者，导致烧伤伤口感染，并在尿管和心脏支架等植入设备上形成生物膜。铜绿假单胞菌由于其外膜的低渗透性和药物外排泵系统的上调，对许多抗微生物剂具有内在的耐药性。生物膜的形成进一步加剧了耐药性，生物膜由分泌的胞外多糖、蛋白质和dna组成的基质组成，有助于保护体内的细菌免受抗生素作用。同时，生物膜形成后，其内的细菌还会出现基因表达的适应性变化，转变为代谢活性较低的状态。因此，寻找、确定生物膜内铜绿假单胞菌的靶向适配体具有重要意义。
2、适配体(aptamer)是一种短的单链dna或rna寡核苷酸，可以针对多种靶点物质进行特异性选择、识别。目前均是利用selex(通过指数富集法的配体的系统进化)方法来选择适配体。然而由于selex技术尚不成熟，批次发酵不同导致菌体之间存在的差异，与靶标菌体结合后容易被菌体内广泛存在的核酸酶降解，以及对操作人员的技术需求高等原因，能够确定与铜绿假单胞菌具有高特异性的靶向适配体具有广泛的市场需求和重要的应用价值。目前还没有针对靶向生物膜内铜绿假单胞菌的高特异性适配体。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术提供靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞
2、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术提供一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.13所示。
4、本专利技术提供一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.24所示。
5、本专利技术提供一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.28所示。
6、本专利技术还提供序列如seq id no.13所示的核酸适配体基于其核苷酸序列的二级结构的截短单链核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.31所示。
7、本专利技术还提供序列如seq id no.24所示的核酸适配体基于其核苷酸序列的二级结构的截短单链核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.32所示。
8、本专利技术还提供序列如seq id no.28所示的核酸适配体基于其核苷酸序列的二级结构的截短单链核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.33所示。
9、上述核苷酸序列如seq id no.13、seq id no.24、seq id no.28、seq id no.31、seq id no.32、seq id no.33所示的核酸适配体在靶向识别生物膜铜绿假单胞菌方面的应用。
10、本专利技术还提供一种获得上述靶向特异性识别生物膜铜绿假单胞菌的核酸适配体的筛选方法，构建随机文库；基于特异性引物对，制备生物素标记的次级文库；进行筛选：以铜绿假单胞菌为正筛菌株，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌和溶壁微球菌为反筛选菌株，所述筛选第1-7轮为正筛选，第8-11轮为反筛选，第12-15轮为正筛选。
11、具体为：构建随机文库，以生物素标记的核苷酸序列(5’biotin-ccctctgtcgtcacctctgtgtgc)和以未标记的核苷酸序列(5’tcagtcccttcgccgtctcgtt)为引物对制备次级文库；以铜绿假单胞菌进行正筛选，以大肠杆菌、溶壁微球菌、金黄葡萄球菌和枯草芽孢杆菌进行反筛选，获得特异性结合生物膜铜绿假单胞菌的ssdna文库；进行测序，测序后，选择自由能低，靶向铜绿假单胞菌的高亲和力特异性序列，确定为靶向特异性识别生物膜铜绿假单胞菌的核酸适配体。
12、进一步的，所述随机文库为5’-tcagtcccttcgccgtctcgtt-n40-gcacacagaggtgacgacagaggg-3’。中间为40个核苷酸的随机区域，5’端和3’端分别为22个和24个核苷酸的固定区域，序列总长为86个核苷酸。
13、进一步的，铜绿假单胞菌为通过分离形成生物膜的铜绿假单胞菌，其具体制备方法为：将铜绿假单胞菌接种于带有玻片的细胞培养板，培养至生物膜形成。后取出玻片，用超声和0.9％nacl溶液洗涤收集形成生物膜的铜绿假单胞菌细胞。
14、进一步的，所述获得特异性结合生物膜铜绿假单胞菌的ssdna文库为第15轮筛选获得的ssdna文库。
15、进一步的，所述进行测序具体为：将第15轮富集的ssdna扩增后，连接t载体，转入大肠杆菌后进行测序。获得30个特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.1-30所示。
16、进一步的，靶向铜绿假单胞菌的高亲和力特异性序列的获得方法包括：以生物素标记的核苷酸序列(biotin-ccctctgtcgtcacctctgtgtgc)和以fam标记的核苷酸序列(fam-tcagtcccttcgccgtctcgtt)引物对，分别制备核苷酸序列如seq id no.1-30的30种ssdna。采用4种不同反筛选菌，利用荧光强度确定靶向铜绿假单胞菌的高亲和力3条特异性序列apt13、apt24和apt28，其具体序列信息为seq id n0.13，seq id n0.24和seq id n0.28。基于上述三条核苷酸序列的二级结构，筛选出具有更高特异性靶向识别生物膜铜绿假单胞菌的的截短ssdna序列seq id n0.31，seq id n0.32和seq id n0.33，其中seq id n0.31靶向识别生物膜铜绿假单胞菌的亲和力最优。
17、本专利技术与现有技术相比的有益效果是：
18、本专利技术一共提供了六条均对生物膜铜绿假单胞菌具有靶向特异性识别的ssdna序列seq id n0.13，seq id n0.24，seq id n0.28，seq id n0.31，seq id n0.32和seq idn0.33。本专利技术将第15轮筛选后获得的ssdna文库，测序，确定序列；选择自由能、与生物膜铜绿假单胞菌结合的平衡常数kd值皆较低，且高特异性靶向铜绿假单胞菌的三条核苷酸序列，序列信息为seq id n0.13，seq id n0.24和seq id n0.28。基于此三条核苷酸序列的二级结构，筛选出具有更高亲和力靶向识别生物膜铜绿假单胞菌的的截短ssdna序列，序列信息为seq id n0.31，seq id n0.32和se本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
2.一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
3.一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，其核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
4.如权利要求1所述的一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，序列如SEQ ID NO.13所示的核酸适配体基于其核苷酸序列的二级结构的截短单链核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。
5.如权利要求2所述的一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，序列如SEQ ID NO.24所示的核酸适配体基于其核苷酸序列的二级结构的截短单链核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
6.如权利要求3所述的一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，序列如SEQ ID NO.28所示的核酸适配体基于其核苷酸序列的二
7.如权利要求1-6任一项所述的靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体在靶向识别生物膜铜绿假单胞菌方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，其核苷酸序列如seq id no.13所示。
2.一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，其核苷酸序列如seq id no.24所示。
3.一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，其核苷酸序列如seq id no.28所示。
4.如权利要求1所述的一种靶向特异性识别生物膜内铜绿假单胞菌的核酸适配体，其特征是，序列如seq id no.13所示的核酸适配体基于其核苷酸序列的二级结构的截短单链核酸适配体，其核苷酸序列如seq id no.31所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：李成，张钟允，刘本康，王亮，刘冰南，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：
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