【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于crispr-cas12a系统和纳米复合材料检测ldl的方法。
技术介绍
1、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,ldl)由极低密度脂蛋白(vldl)转变而来，是携带胆固醇最多的脂蛋白。目前，通常通过超速离心、层析、电泳、化学或免疫沉淀等方法将低密度脂蛋白与其他脂蛋白分离，进而测定低密度脂蛋白成分中的胆固醇含量。公开号为cn 112697565a的专利技术专利，涉及一种改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，优化了丙烯酰胺凝胶浓度和苏丹黑b染色液配置方法，实现精准分离和定量分析血清ldl，但该方法需要进行染色处理，操作复杂。公开号为cn115901706a的专利技术专利，涉及一种基于氮硫共掺杂量子点-四氧化三铁@还原性氧化石墨烯(n,s-gqds-fe3o4@rgo)的荧光适配体传感器检测ldl的方法，其利用fe3o4@rgo良好的猝灭能力和n,s-gqd s的高荧光强度，构建了一种定量检测ldl的适配体荧光传感器，但是该方法对ldl的检测灵敏度较低。因此，需要建立一种高灵敏度，操作简单的ldl痕量检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是构建具有ldl特异性启动的crispr-cas12a切割系统，以及提供一种基于还原氧化石墨烯-碳化钛-氧化亚铜纳米复合材料(rgo-mxene-cu2onps)，构建电化学传感器，实现ldl的检测，该方法最低检测限是0.988ng/ml。
2、为
3、本专利技术按照以下步骤进行：
4、步骤1：crispr-cas12a信号放大体系构建
5、(1)aptamer-activator捕获探针的合成与验证：合成优选的ldl适配体序列，对ldl适配体(aptamer)进行验证。根据ldl适配体序列，设计出部分互补的dna序列(activator)，将activator与aptamer混合。进行退火处理，以形成“aptamer-activator”dna复合物。离心处理，保留下层溶液。在下层液加入ldl蛋白，aptamer优先与ldl结合，释放activator。离心处理，保留activator上清液。
6、(2)cas12a-crrna复合物的设计与制备：根据ldl适配体序列，设计出的部分互补序列activator，结合crrna固有骨架序列，最终设计出完整的crrna序列。crrna进行退火处理，以使形成特定的结构。然后将cas12a蛋白和crrna混合，形成cas12a-crrna复合物溶液。
7、(3)crispr-cas12a系统切割活性验证：将activator上清液加入到cas12a-crrna溶液中，振荡孵育。形成激活反式切割活性的crispr-cas12a系统，验证其切割活性。
8、步骤2：还原氧化石墨烯-碳化钛-氧化亚铜纳米复合材料/ssdna rgo-mxene-cu2onps/ssdna电化学传感界面的构建
9、(1)rgo-mxene-cu2o nps的制备：超纯水中加入氧化石墨烯(go)粉末，超声破碎，得到go悬浮液；加入抗坏血酸(aa)，搅拌得到还原氧化石墨烯溶液(rgo)。超纯水中加入碳化钛(mxene)粉末，使用超声细胞破碎仪破碎，得到mxene悬浮液；将mxene悬浊液加入到rgo溶液中，搅拌得到还原氧化石墨烯-(rgo-mxene)。将硝酸铜(cu(no3)2)溶于超纯水，加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，最后加入naoh，形成蓝色沉淀。将水合肼溶液加入混合物中搅拌，干燥，得到氧化亚铜(cu2o)。将cu2o加入到rgo-mxene溶液中搅拌，得到rgo-mxene-cu2o nps溶液。
10、(2)丝网印刷碳电极(spe)的活化与aunps修饰：将丝网印刷电极置于h2so4溶液中循环伏安法(cv)扫描活化。将活化后的丝网印刷电极置于氯金酸(haucl4)中，进行沉积，得到aunps/spe电极。
11、(3)rgo-mxene-cu2o/ssdna电化学传感界面的制备：在au nps/spe上滴加rgo-mxene-cu2o nps溶液，晾干。滴加氨基化的ssdna，干燥。使用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗，将未连接的ssdna去除。
12、步骤3：ldl工作曲线的绘制
13、(1)将步骤1的ldl激活的crispr-cas12a反式切割系统滴加在步骤2的ssdna/rgo-mxene-cu2o nps/aunps/spe传感器上，反应一段时间，用pbs冲洗；置于pbs缓冲溶液中，采用电化学工作站的dpv进行扫描，记录传感器的响应电流值。
14、(2)检测不同浓度的ldl，记录电流峰值，根据该浓度下的响应电流峰值与ldl浓度的关系，绘制ldl工作曲线。
15、步骤4：实际血清样本中ldl的检测
16、(1)将实际血清样本加入到步骤1的aptamer-activator捕获探针，收集activator，激活crispr-cas12a系统，并将其滴加到rgo-mxene-cu2o nps/ssdna电化学传感界面。采用dpv检测技术进行扫描，记录电流响应峰值。
17、(2)根据步骤3所得到的工作曲线，计算待测样本中ldl的浓度。
18、优选，步骤1中所述退火温度为95℃，退火时长为10min，降温速率为1℃/s；
19、优选，步骤1中所述ldl与aptamer-activator捕获探针结合时间为30min，离心分离转速为12000rpm，时间为2min。
20、优选，步骤2中所述rgo-mxene-cu2o nps溶液的浓度为1.0mg/ml；
21、优选，步骤2中所述稀h2so4溶液的浓度为0.5mol/l，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas12a系统和RGO-Mxene-Cu2O NPs的电化学检测LDL的方法，按以下步骤进行：
2.按照权利要求1所述检测LDL的方法，其特征在于：步骤1中所述水浴加热的温度为95℃，冷却温度下降速率为0.1℃/s。
3.按照权利要求1所述检测LDL的方法，其特征在于：步骤1中所述孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
4.按照权利要求1所述检测LDL的方法，其特征在于：步骤1中所述离心转速为14000rpm，离心时间为1min。
5.按照权利要求1所述检测LDL的方法，步骤2中所述RGO-Mxene-Cu2O NPs溶液的浓度为1.0mg/mL。
6.按照权利要求1所述检测LDL的方法，步骤2中所述H2SO4溶液的浓度为0.5mol/L；循环伏安法(CV)扫描电压为0.4V～1.2V；HAuCl4溶液浓度为0.01％；恒电压为-0.5V，扫描时间为2min；PBS的浓度为0.2mol/L。
7.按照权利要求1所述检测LDL的方法，步骤3中所述电压范围0.2V～1.0V。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas12a系统和rgo-mxene-cu2o nps的电化学检测ldl的方法，按以下步骤进行：
2.按照权利要求1所述检测ldl的方法，其特征在于：步骤1中所述水浴加热的温度为95℃，冷却温度下降速率为0.1℃/s。
3.按照权利要求1所述检测ldl的方法，其特征在于：步骤1中所述孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
4.按照权利要求1所述检测ldl的方法，其特征在于：步骤1中所述离心转速为14000rpm，离心时间为1min。
5.按照权利要求1所述检测ldl的方法，步骤2中所述rgo-mxene-cu2o...
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