【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及与n末端泛素化多肽的肽结合的抗体及其使用方法。
技术介绍
1、蛋白质泛素化是调节多种细胞功能(包括蛋白质稳态、dna损伤反应、先天性和适应性免疫、细胞周期和炎症信号传导)的复杂的翻译后修饰(komander,d.&rape,m.annulrev biochem 81,203-229(2012)；yau,r.&rape,m.nat cell biol 18,579-586(2016)；swatek,k.n.&komander,d.cell res 26,399-422(2016)；dittmar,g.&winklhofer,k.f.front chem 7,915(2020))。泛素(ub)与蛋白质底物的共价连接是通过三种酶的协同活性发生的：e1 ub-激活酶、e2 ub-缀合酶和e3 ub-连接酶(deshaies,r.j.&joazeiro,c.a.p.annu rev biochem 78,399-434(2009)；schulman,b.a.&harper,j.w.nat rev molcell bio 10,319-331(2009)；ye,y.&rape,m.nat rev mol cell bio 10,755-764(2009))。ub本身具有七个赖氨酸残基(k6、k11、k27、k29、k33、k48和k63)和一个n末端，这些中的所有都适合缀合(komander,d.&rape,m.annu rev biochem 81,203-22
2、最初发现时，n末端ub被认为可作为蛋白质降解信号(breitschopf,k.等人,emboj 17,5964-5973(1998)；bloom,j.等人,cell 115,71-82(2003)；coulombe,p.等人,molcell biol 24,6140-6150(2004))。这些研究表明，缺乏赖氨酸残基的工程化蛋白或天然存在的低赖氨酸蛋白仍然会受到蛋白酶体降解，这间接暗示n末端ub为降解信号。随后的工作表明，n末端泛素化蛋白在蛋白酶体抑制时不会显著积累，这表明n末端泛素化除了促进蛋白酶体介导的降解之外可能还具有额外的作用(akimov,v.等人,nat struct mol biol25,631-640(2018))，如协助新生多肽的折叠(finley,d.等人,nature 338,394-401(1989))。除了由lubac形成的线性多聚泛素链外，ube2w是唯一据报道在ub的c末端gly-76与底物蛋白n末端的α-氨基之间形成肽键的e2 ub-缀合酶或e3连接酶(scaglione,k.m.等人,j biol chem 288,18784-18788(2013)；kirisako,t.等人embo j 25,4877-4887(2006))。与泛素连接酶配合，目前的数据表明ube2w在其n末端严格单泛素化蛋白质底物。这些引发修饰可以通过其它e2/e3复合物加工成n末端连接的多聚泛素链(tatham,m.h.等人,biochem j 453,137-145(2013))。有趣的是，ube2w包含部分无序的c末端，这对于识别具有内在无序的n末端的底物至关重要(vittal,v.等人,nat chem biol 11,83-89(2015))。尽管对n末端泛素化以及ube2w的结构和生化特性的了解日益加深，但仅鉴定出一小部分n末端泛素化的ube2w底物。因此，需要鉴定n末端泛素化蛋白的新策略，以进一步阐明这种修饰的生理后果。
3、特别地，对与质谱相容的n末端泛素化蛋白进行全局分析的策略将特别有益。质谱(ms)是一种强大的分析工具，用于在氨基酸残基水平上鉴定和阐明底物特异性泛素化(peng,j.等人nat biotechnol 21,921-926(2003)；kim,w.等人mol cell 44,325-340(2011)；wagner,s.a.等人mol cell proteomics 10,m111.013284(2011))。一种方法是产生特异性地富集酶切割时产生的带有ub c末端残余物的肽的工具。例如，开发了识别由附着至赖氨酸侧链的异肽连接的双甘氨肽(k-ε-gg)组成的胰蛋白酶ub残余物的单克隆抗体，可以对泛素化位点进行全局分析(kim,w.等人mol cell 44,325-340(2011)；xu,g.等人,nat biotechnol 28,868-873(2010)；bustos,d.等人,mol cell proteomics 11,1529-1540(2012))。最近，产生了单克隆抗体以识别延伸的lysc-产生的ub的残余物，并区分缀合至ub的底物与其它ub-样蛋白(如nedd8和isg15)(akimov,v.等人,nat struct mol biol25,631-640(2018))。还开发了其它基于亲和力的富集或遗传标签系统(akimov,v.等人,nat struct mol biol 25,631-640(2018)；peng,j.等人nat biotechnol 21,921-926(2003)；akimov,v.等人,j proteome res本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与N末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中所述抗体与所述肽的N末端处的氨基酸序列GGX结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(K-ε-GG)结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与包含选自由以下项组成的组的N末端序列的肽结合：GGA、GGE、GGF、GGG、GGH、GGI、GGL、GGM、GGN、GGQ、GGS、GGT、GGV和GGW。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述抗体与以下结合：包含GGA的N末端序列的肽、包含GGE的N末端序列的肽、包含GGF的N末端序列的肽、包含GGG的N末端序列的肽、包含GGH的N末端序列的肽、包含GGI的N末端序列的肽、包含GGL的N末端序列的肽、包含GGM的N末端序列的肽、包含GGN的N末端序列的肽、包含GGQ的N末端序列的肽、包含GGS的N末端序列的肽、包含GGT的N末端序列的肽、包含GGV的N末端序列的肽，以及包含GGW的N末端序列的肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体为兔、啮齿动物或山羊抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合至可检测标记物。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体固定在固体支持物上。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体固定在珠粒上。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含根据Kabat编号含有在一侧的位置35处的Asn、位置37处的Val、位置93处的Thr、位置101处的Asn和位置103处的Trp的可变重链(VH)，以及含有位置34处的Ala、位置36处的Tyr和位置49处的Tyr的可变轻链(VL)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有氨基酸序列XXXMN(SEQ ID NO:35)的CDRH1；含有氨基酸序列XXXXXGXXYYATWA(SEQ ID NO:36)的CDRH2；以及含有氨基酸序列DDXXXXNX(SEQ ID NO:37)的CDRH3；其中所述抗体包含含有氨基酸序列QSXXSVYXXNXLX(SEQ ID NO:38)的CDRL1；含有氨基酸序列XASTLXS(SEQ ID NO:39)的CDRL2；以及含有氨基酸序列LGXXDCXSXDCXX(SEQ ID NO:40)的CDRL3；其中X为任何氨基酸。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸，并且所述VL包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:4中所示的CDRH2氨基酸序列；SEQ ID NO:5中所示的CDRH3氨基酸序列；SEQ ID NO:6中所示的CDRL1氨基酸序列；SEQ ID NO:7中所示的CDRL2氨基酸序列；以及SEQID NO:8中所示的CDRL3氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3，以及含有SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:11中所示的CDRH1氨基酸序列；SEQ ID NO:1...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种与n末端泛素化多肽的肽结合的抗体，其中所述抗体与所述肽的n末端处的氨基酸序列ggx结合，其中所述抗体不与包含支链双甘氨肽的氨基酸序列(k-ε-gg)结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与包含选自由以下项组成的组的n末端序列的肽结合：gga、gge、ggf、ggg、ggh、ggi、ggl、ggm、ggn、ggq、ggs、ggt、ggv和ggw。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述抗体与以下结合：包含gga的n末端序列的肽、包含gge的n末端序列的肽、包含ggf的n末端序列的肽、包含ggg的n末端序列的肽、包含ggh的n末端序列的肽、包含ggi的n末端序列的肽、包含ggl的n末端序列的肽、包含ggm的n末端序列的肽、包含ggn的n末端序列的肽、包含ggq的n末端序列的肽、包含ggs的n末端序列的肽、包含ggt的n末端序列的肽、包含ggv的n末端序列的肽，以及包含ggw的n末端序列的肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体为兔、啮齿动物或山羊抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全长抗体或fab片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体缀合至可检测标记物。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述标记物选自由以下项组成的组：生物素、地高辛和荧光素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体固定在固体支持物上。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体固定在珠粒上。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含根据kabat编号含有在一侧的位置35处的asn、位置37处的val、位置93处的thr、位置101处的asn和位置103处的trp的可变重链(vh)，以及含有位置34处的ala、位置36处的tyr和位置49处的tyr的可变轻链(vl)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(vh)和可变轻链(vl)，其中所述抗体包含含有氨基酸序列xxxmn(seq id no:35)的cdrh1；含有氨基酸序列xxxxxgxxyyatwa(seq id no:36)的cdrh2；以及含有氨基酸序列ddxxxxnx(seq id no:37)的cdrh3；其中所述抗体包含含有氨基酸序列qsxxsvyxxnxlx(seq id no:38)的cdrl1；含有氨基酸序列xastlxs(seq id no:39)的cdrl2；以及含有氨基酸序列lgxxdcxsxdcxx(seq id no:40)的cdrl3；其中x为任何氨基酸。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述vh包含seq id no:33中所示的氨基酸，并且所述vl包含seq id no:34中所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(vh)和可变轻链(vl)，其中所述抗体包含含有seq id no:1中所示的氨基酸序列的vh的cdrh1、cdrh2和cdrh3，以及含有seq id no:2中所示的氨基酸序列的vl的cdrl1、cdrl2和cdrl3。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含seq id no:3中所示的cdrh1氨基酸序列；seq id no:4中所示的cdrh2氨基酸序列；seq id no:5中所示的cdrh3氨基酸序列；seq id no:6中所示的cdrl1氨基酸序列；seq id no:7中所示的cdrl2氨基酸序列；以及seqid no:8中所示的cdrl3氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的抗体，其中所述vh包含seq id no:1中所示的氨基酸序列，并且所述vl包含seq id no:2中所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含seq id no:52中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含seq id no:53中所示的氨基酸。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(vh)和可变轻链(vl)，其中所述抗体包含含有seq id no:9中所示的氨基酸序列的vh的cdrh1、cdrh2和cdrh3，以及含有seq id no:10中所示的氨基酸序列的vl的cdrl1、cdrl2和cdrl3。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体包含seq id no:11中所示的cdrh1氨基酸序列；seq id no:12中所示的cdrh2氨基酸序列；seq id no:13中所示的cdrh3氨基酸序列；seq id no:14中所示的cdrl1氨基酸序列；seq id no:15中所示的cdrl2氨基酸序列；以及seq id no:16中所示的cdrl3氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述vh包含seq id no:9中所示的氨基酸序列，所述vl包含seq id no:10中所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含seq id no:54中所示的氨基酸序列，并且所述轻链包含seq id no:55中所示的氨基酸。
21.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含可变重链(vh)和可变轻链(vl)，其中所述抗体包含含有seq id no:17中所示的氨基酸序列的vh的cdrh1、cdrh2和cdrh3，以及含有seq id no:18中所示的氨基酸序列的vl的cdrl1、cdrl2和cdrl3。
22.根据权利要求21所述的抗体，其中所述抗体包含seq id no:19中所示的cdrh1氨基酸序列；seq id no:20中所示的cdrh2氨基酸序列；seq id no:21中所示的cdrh3氨基酸序列；seq id no:22中所示的cdrl1氨基酸序列；seq id no:23中所示的cdrl2氨基酸序列；以及seq id no:24中所示的cdrl3氨基酸序列。
23.根据权利要求22所述的抗体，其中所述vh包含seq id no:17中所示的氨基酸，并且所述vl包含seq id no:18中...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·S·柯克帕特里克，J·T·柯伯，C·W·戴维斯，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：
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