【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产唾液酸乳糖的基因工程菌及其应用，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
1、人乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是由200多种结构复杂、不易消化、非营养性碳水化合物组成的复杂混合物，在母乳中的含量仅次于乳糖和脂质。研究表明，人乳喂养的新生儿患肠胃炎、急性中耳炎以及其他免疫类疾病的概率较非母乳喂养显著降低，甚至在未来的智商发育上都占据优势，产生肥胖和糖尿病的概率也会下降，这与人乳中的hmos密切相关。hmos作为母乳中重要的免疫活性成分，对婴幼儿健康及生长发育起到至关重要的作用，并且越来越多的动物和临床试验证实了hmos的有益特性，例如作为益生元维持肠道生态平衡、抵抗病原菌的黏附、免疫调节及促进神经系统发育和修复等多种功能活性。hmos主要可以分为三大类：(1)岩藻糖基化的中性hmos；(2)唾液酸化的酸性hmos；(3)非岩藻糖基化的中性hmos。唾液酸化hmos约占总hmos的13％，其中唾液酸乳糖(3(6)'-sialyllactose，3(6)'-sl)是具有代表性且最简单的化合物，其含量约为2％。3(6)'-sl在结构上表示为neu5acα2,3(6)galβ1,4glc，由n-乙酰神经氨酸(neu5ac)和乳糖单元组成。已被广泛证实具有良好的益生元作用、抗粘附抗菌剂、抗病毒活性、预防坏死性小肠结肠炎(nec)、免疫调节、调节肠上皮细胞反应、促进大脑发育和改善认知等功能。目前欧盟已经批准了3'-唾液酸乳糖钠盐了和6'-唾液酸乳糖钠盐作为新型食品应用于婴幼儿奶粉和食
2、3(6)'-sl的合成方法主要包括化学合成、酶法合成和生物发酵合成。3(6)'-sl的化学合成需要众多繁琐的保护和脱保护步骤。酶促合成由于供体底物核苷酸糖相对昂贵且产量低，使得合成的3(6)'-sl成本较高。相比于酶法合成，以微生物发酵法合成3(6)'-sl更加高效和安全。2002年，priem等以大肠杆菌jm107为宿主，首次报道了代谢工程菌株发酵产生3'-sl的生物合成。2008年eric samain等通过沉默nant、nana、nank、nane，过表达neub、neua、neuc以及α-2,3唾液酸转移酶，生成25.5g/l的3'-sl；2010年该课题组以同样方法构建6'-sl路径，仅将3'-sl从头合成路径中的α-2,3唾液酸转移酶更改为α-2,6唾液酸转移酶，发酵获得34g/l的6'-sl为最高产量。此外，zhang等通过失活lacz、nana和nank，异源过表达3'-sl途径基因，在补料分批发酵中获得23.1g/l的胞外产量。但目前报道的微生物生产的方法及唾液酸乳糖的产量仍不能满足工业化生产的需求。因此，寻求廉价高产的唾液酸乳糖从头合成途径来解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是目前急需解决的问题。
技术实现思路
1、针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种高效生产唾液酸乳糖的大肠杆菌工程菌及其构建方法。
2、本专利技术还提供了一种底盘细胞，所述底盘细胞是以大肠杆菌为宿主，敲除了β-半乳糖苷酶编码基因lacz、唾液酸醛缩酶基因nana、6-磷酸果糖激酶编码基因pfka、n-乙酰甘露糖胺激酶基因nank和甘露糖-6-磷酸异构酶基因mana。
3、在本专利技术的一种实施方式中，所述底盘细胞是以e.coli mg1655、e.coli dh5α、e.coli bl21(de3)、e.coli jm109或e.coli hb101中的任一为表达宿主
4、本专利技术提供一种制备3'-sl的基因工程菌，所述重组大肠杆菌为：缺失大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶编码基因lacz、唾液酸醛缩酶基因nana、6-磷酸果糖激酶编码基因pfka、n-乙酰甘露糖胺激酶基因nank和甘露糖-6-磷酸异构酶基因mana，并异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neub基因、编码n-乙酰葡萄糖胺异构酶的neuc基因、编码cmp-唾液酸合成酶的neua基因、唾液酸乳糖转移酶基因lst；还过表达乳糖转移酶编码基因lacy、谷氨酰胺合成酶编码基因glna和udp-乙酰葡糖胺合成途径基因；
5、所述udp-乙酰葡糖胺合成途径为葡萄糖胺-6-磷酸合成酶编码基因glms、葡萄糖胺合成酶编码基因glmm和udp-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmu。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是采用seq id no.2～4任一所述的rbs调控目的基因唾液酸乳糖转移酶基因的蛋白翻译强度。
7、在本专利技术的一种实施方式中，采用核苷酸序列如seq id no.5～7所示的mbp蛋白、infb蛋白和pelb蛋白作为融合蛋白标签；将mbp蛋白、infb蛋白或pelb蛋白通过融合在唾液酸乳糖转移酶的n端来提高其可溶性表达。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶的编码基因lacz的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述唾液酸醛缩酶基因nana的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述6-磷酸果糖激酶编码基因pfka的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述n-乙酰甘露糖胺激酶基因nank的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因mana的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neub基因的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述编码n-乙酰葡萄糖胺异构酶的neuc基因的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述编码cmp-唾液酸合成酶的neua基因的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述唾液酸乳糖转移酶基因lst的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述乳糖转移酶编码基因lacy的核苷酸序列如seq id no.18所示，所述谷氨酰胺合成酶编码基因glna的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶编码基因glms的核苷酸序列如seq id no.20所示，所述葡萄糖胺合成酶编码基因glmm的核苷酸序列如seq id no.21所示，所述udp-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmu的核苷酸序列如seq id no.22所示。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述缺失是指敲除或不表达。
10、在本专利技术的一种实施方式中，利用petduet-1、prsfduet-1和pcdfduet-1质粒进行过表达。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是以e.coli mg1655、dh5α、bl21(de3)、jm109或hb101中的任一为表达宿主。
12、本专利技术提供一种制备6'-sl的基因工程菌，所述重组大肠杆菌为：缺失大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶编码基因lacz、唾液酸醛缩酶基因nana、6-磷酸果糖激酶编码基因pfka、n-乙酰甘露糖胺激酶基因nank和甘露糖-6-磷酸异构酶基因mana，并异源表达编码乙酰神经本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种底盘细胞，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，敲除了β-半乳糖苷酶编码基因lacZ、唾液酸醛缩酶基因nanA、6-磷酸果糖激酶编码基因pfkA、N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK和甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA；优选的，所述底盘细胞是以E.coli MG1655、E.coliDH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109或E.coli HB101中的任一为表达宿主。
2.一种生产唾液酸乳糖的基因工程菌，其特征在于，以权利要求1的底盘细胞为宿主，异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neuB基因、编码N-乙酰葡萄糖胺异构酶的neuC基因、编码CMP-唾液酸合成酶的neuA基因、编码唾液酸乳糖转移酶的基因lst或pst6-224；同时还过表达了编码谷氨酰胺合成酶的基因glnA和UDP-乙酰葡糖胺合成途径基因；
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是采用SEQ IDNO.2～4任一所述的RBS调控目的基因唾液酸乳糖转移酶基因的蛋白翻译强度；优选的，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示的MBP蛋白、InfB蛋
4.根据权利要求1所述的底盘细胞或权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶的编码基因lacZ的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述唾液酸醛缩酶基因nanA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述6-磷酸果糖激酶编码基因pfkA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neuB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述N-乙酰葡萄糖胺异构酶的neuC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述CMP-唾液酸合成酶的neuA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述唾液酸乳糖转移酶基因lst的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述唾液酸乳糖转移酶基因pst6-224的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，所述谷氨酰胺合成酶编码基因glnA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶编码基因glmS的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述葡萄糖胺合成酶编码基因glmM的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmU的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
5.根据权利要求2～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是，以敲除了β-半乳糖苷酶编码基因lacZ、唾液酸醛缩酶基因nanA、6-磷酸果糖激酶编码基因pfkA、N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK和甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA的E.coli MG1655、E.coliDH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109或E.coli HB101中的任一为表达宿主。
6.一种提高大肠杆菌发酵生产唾液酸乳糖的方法，其特征在于，所述方法为，缺失大肠杆菌基因组上的β-半乳糖苷酶编码基因lacZ、唾液酸醛缩酶基因nanA、6-磷酸果糖激酶编码基因pfkA、N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK和甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA，并异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neuB基因、编码N-乙酰葡萄糖胺异构酶的neuC基因、编码CMP-唾液酸合成酶的neuA基因、唾液酸乳糖转移酶基因lst或pst6-224；同时还过表达了谷氨酰胺合成酶编码基因glnA和UDP-乙酰葡糖胺合成途径基因；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli MG1655、E.coliDH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109或E.coli HB101中的任一种。
8.一种制备唾液酸乳糖的方法，其特征在于，所述方法为，以甘油为碳源，以乳糖为底物，利用权利要求2～5任一所述的基因工程菌为发酵菌株，发酵生产唾液酸乳糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系中，甘油的添加量为：15～25g/L；优选的，所述乳糖的添加量为：5～15g/L。
10.权利要求2～5任一所述的基因工程菌或权利要求...
【技术特征摘要】
1.一种底盘细胞，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，敲除了β-半乳糖苷酶编码基因lacz、唾液酸醛缩酶基因nana、6-磷酸果糖激酶编码基因pfka、n-乙酰甘露糖胺激酶基因nank和甘露糖-6-磷酸异构酶基因mana；优选的，所述底盘细胞是以e.coli mg1655、e.colidh5α、e.coli bl21(de3)、e.coli jm109或e.coli hb101中的任一为表达宿主。
2.一种生产唾液酸乳糖的基因工程菌，其特征在于，以权利要求1的底盘细胞为宿主，异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neub基因、编码n-乙酰葡萄糖胺异构酶的neuc基因、编码cmp-唾液酸合成酶的neua基因、编码唾液酸乳糖转移酶的基因lst或pst6-224；同时还过表达了编码谷氨酰胺合成酶的基因glna和udp-乙酰葡糖胺合成途径基因；
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是采用seq idno.2～4任一所述的rbs调控目的基因唾液酸乳糖转移酶基因的蛋白翻译强度；优选的，采用核苷酸序列如seq id no.5～7所示的mbp蛋白、infb蛋白和pelb蛋白作为融合蛋白标签，将mbp蛋白、infb蛋白或pelb蛋白通过融合在唾液酸乳糖转移酶的n端来提高唾液酸乳糖转移酶的表达；优选的，所述基因工程菌利用petduet-1、prsfduet-1和pcdfduet-1质粒进行过表达。
4.根据权利要求1所述的底盘细胞或权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶的编码基因lacz的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述唾液酸醛缩酶基因nana的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述6-磷酸果糖激酶编码基因pfka的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述n-乙酰甘露糖胺激酶基因nank的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因mana的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neub基因的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述n-乙酰葡萄糖胺异构酶的neuc基因的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述cmp-唾液酸合成酶的neua基因的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述唾液酸乳糖转移酶基因lst的核苷酸序列如seq id ...
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