一种多羟基甾醇衍生物及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术，具体的说是一种多羟基甾醇衍生物及其制备和应用。所述多羟基甾醇衍生物如式Ａ所示，制备方法为将真菌产黄青霉Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ?ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ于ＰＤＡ以２０－３５℃培养４－７天作为菌种；将上述菌种接种于固体培养基中，以２０－３５℃发酵培养３０－３５天；所得发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡２－３次，而后浓缩蒸干；而后采用硅胶柱进行色谱分离，即得式Ａ化合物。所述式Ａ所示多羟基甾醇衍生物具有抑制真菌的作用。本发明专利技术制备所得多羟基甾醇衍生物利用微生物进行发酵生产，具有操作工艺简单，生产周期短、产品成本低的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物技术，具体的说是一种多羟基留醇衍生物及其制备和应用。真菌是具有真核和细胞壁的异养生物。种属很多，已报道的属达1万以上，种超过 10万个。其营养体除少数低等类型为单细胞外，大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。在 报道的文献中，很多真菌是病原微生物。如黑曲霉Aspergillus niger能引起水分较高粮 食的霉变，黄曲霉Aspergillus flavus能引起幼蚕期的一些重要疾病等等。目前已有文献 报道甾醇衍生物的抗真菌活性(Gallimore ff A et al.，J. Nat. Prod.，2001，64，741-744 ； Bruno I et al.，J. Nat. Prod.，1993，56，1057-1064 ；Chludil H D et al.，J. Nat. Prod.， 2005，68，1279-1283)。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种具有抗真菌活性的多羟基留醇衍生物，及其提 取、制备该衍生物的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种多羟基留醇衍生物所述多羟基留醇衍生物如式A所示 制备方法，按如下步骤1)将真菌产黄青霉EN-24S于PDA以20_35°C培养4_7天作为菌种；2)将上述菌种接种于固体培养基中，以20_35°C发酵培养30-35天；所得发酵产物 用过量的乙酸乙酯浸泡2-3次，而后浓缩蒸干得总提取物；3)将上述所得总提取物用氯仿-甲醇溶解，然后用硅胶柱进行色谱分离，先经石 油醚_乙酸乙酯洗脱后再由氯仿_甲醇洗脱；4)收集上述由氯仿-甲醇体积比20 1至10 1的梯度洗脱下的组分，将洗脱 组分再由硅胶柱层析，收集洗脱液体积比10 1梯度的洗脱组分，纯化后即为式A化合物。所述PDA培养基成分为陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL、葡萄糖20g 和琼脂20g，PH 6. 5-7. 0。所述陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL为每200g马铃薯 加入1000mL海水。所述固体培养基的组成为大米100g，陈海水100mL，蛋白胨0. 6g。所述 步骤3)中石油醚-乙酸乙酯梯度为1 0至0 1;氯仿-甲醇梯度为20 1至1 1。
技术介绍
所述步骤4)再次硅胶柱层析是的洗脱液为氯仿-甲醇，梯度为20 1至10 1;所述步 骤4)纯化为将洗脱下组分用C-18反相柱纯化，洗脱液为体积比为5 1的甲醇-水，即得 纯化后式A所示化合物。多羟基留醇衍生物的应用所述式A所示多羟基留醇衍生物具有抑制真菌的作 用。所述式A所示多羟基甾醇衍生物具有抑制黑曲霉Aspergillus niger的作用。所述式 A所示多羟基留醇衍生物可作为制备抗真菌的药物。本专利技术化合物多羟基甾醇衍生物即16 3 -乙酰氧基-3 3，6 3， 73，113 -四羟基-麦角甾-22-烯，英文名为 16e-acetOXy-33，63，73， 11 3 -tetrahydroxy-ergost-22-en 能够有效抑制黑曲霉 Aspergillus niger 的生长，采用 滤纸片法抗菌实验发现，其对黑曲霉Aspergillus niger的抑菌圈直径为18mm，表明该化 合物可用作制备抗真菌的药物。本专利技术所具有的优点1.本专利技术制备所得多羟基留醇衍生物可以作为具有抗真菌作用的新药物成分或 先导化合物。2.本专利技术制备所得多羟基留醇衍生物利用微生物进行发酵生产，具有操作工艺简 单，生产周期短、产品成本低的特点。3.本专利技术利用微生物发酵法制备抗真菌化合物对环境无污染。 具体实施例方式通过下面给出的具体实施例可进一步了解本专利技术，但它不是对本专利技术的限定。实施例1多羟基甾醇衍生物如式A所示， 式A化合物的制备1)将真菌产黄青霉EN-24S培养于PDA (potato dextrose agar)培养基中，将培 养基配制成平板，然后将保种管斜面上的菌株挑入平板，以28°C培养4-7天，作为下一步培 养的菌种，待用；所述PDA培养基组成为用陈海水配制的200g的马铃薯浸出液lOOOmL，葡 萄糖20g，琼脂20g，PH6. 5-7. 0。所述陈海水配制的20%的马铃薯浸出液1000mL为每200g 马铃薯加入1000mL海水。陈海水为自然海水经沉降、过滤而得。2)将上述菌种平板上的EN-24S菌株切成约1cm2大小的方块放入含固体培养基 的无菌三角瓶中，总共培养100瓶，28°C培养30天。发酵产物用过量的乙酸乙酯浸泡3次， 然后将乙酸乙酯溶液浓缩蒸干得总提取物；所述固体培养基的组成为大米100g，陈海水 100mL，蛋白胨 0. 6g。3)将上述所得总提取物用体积比为1 1的氯仿_甲醇溶解提取物，溶解物用硅 胶柱进行色谱分离，硅胶柱分离时先经体积比为1 0至0 1梯度的石油醚-乙酸乙酯 洗脱，再经体积比为20 1至1 1梯度的氯仿_甲醇洗脱；4)收集上述由氯仿-甲醇体积比20 1至10 1的梯度洗脱下的组分，将洗脱 组分再由硅胶柱层析，此时洗脱液为梯度为20 1至10 1的氯仿-甲醇；收集洗脱液体 积比10 1梯度的洗脱组分，洗脱组分用C-18反相柱纯化，洗脱液为体积比为10 1的甲 醇-水，即得纯化后白色粉末如式A所示化合物。式A所示化合物其结构鉴定为16 0 -乙酰 氧基-33，63，73，113-四羟基-麦角甾-22-烯，英文名为 16e-acetOXy-33，63，73， 113-tetrahydroxy-ergost-22-en。式 A 所示化合物的实验数据问智+72. 3 (c 0. 47, CH30H). IR(KBr)vmax =3386,2954, 2923, 2869,1712，1457，1380，1265，1168，1103，1037cm-1. ESI-MS :m/z 529 +。式A所示化合物的NMR数据如表1所示。表1 式 A 所示化合物的 NMR 数据(500MHz，in acetone_d6) 实施例2 用滤纸片法检测式A所示化合物抗黑曲霉Aspergillus niger的活性c1 材料1. 1沙氏培养基葡萄糖40g，蛋白胨10g，水1000ml。1. 2滤纸片用打孔机将滤纸制成直径为5mm大小的圆纸片。1. 3配制含0. 25% Tueen-20的0. 85%氯化钠水溶液备用。1. 4 麦氏比浊管(1. 5 X 108CFU/ml)配制 0. 048M 氯化钡 0. 5ml 和 0. 18M 硫酸 99. 5ml，将二液混合，放暗处保存。存放期为六个月，用前混勻，并且需要进一步稀释成 lX106CFU/ml。1. 5 实验用菌株黑曲霉 Aspergillus niger。1. 6 两性霉素 B (Sigma)。2.操作步骤2. 1将斜面上的黑曲霉Aspergillus niger挑入含沙氏培养基的平板，28°C培养 4-7天，直至菌落铺满整个平板。2. 2取lmL 0. 85%氯化钠溶液加入长满黑曲霉Aspergillus niger的平板上，然 后用玻璃刮刀将菌轻轻刮下，再吸入含0. 85%氯化钠溶液的无菌试管中备用。2. 3将试管中菌液与麦氏比浊管进行浓度比对，确定菌液浓度在lX106CFU本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多羟基甾醇衍生物，其特征在于：所述多羟基甾醇衍生物如式Ａ所示：　　＊＊＊　Ａ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌贵，高书山，李晓明，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]