【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于mirna检测，具体涉及一种基于纳米金(aunps)和邻位连接(pla)的mirna检测方法。
技术介绍
1、microrna(mirna)是一类长度为18-25个核苷酸的内源性非编码小分子单链rna，普遍存在于真核细胞中，可以作为疾病标志物用于相关疾病的早期诊断。
2、传统的检测方法包括northern印迹杂交法、微阵列分析法和实时定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)等。尽管这些方法的准确性好，但在实际应用中仍存在一些不足。例如northern印迹杂交法耗时费力，对待测样品都需求量大，不能用于低丰度mirna的检测；微阵列分析法可以实现mirna的多重检测，但是其灵敏度不足，特异性差，动态范围窄，此外芯片的制作和检测费用高；qrt-pcr的灵敏度高，但是mirna序列短，限制了其逆转录步骤。针对现有技术中的不足之处，本专利技术提供了一种基于纳米金颗粒(aunps)和邻位连接反应(pla)的mirna检测方法，以mir-34c-5p为例，期望通过对现有mirna检测手段的改进，实现对mirna的高灵敏度、高特异性检测。
技术实现思路
1、目的是建立一种基于纳米金颗粒(aunps)和邻位连接反应(pla)的mirna检测方法。
2、具体技术方案如下：
3、一种基于纳米金颗粒(aunps)和邻位连接反应(pla)的mirna检测方法，其制备过程包括以下步骤：
4、(1)纳米金颗粒(aunps)的制备将柠檬酸三钠(38.8mm
5、(2)aunps-dna溶液的制备用ddh2o分别溶解dna1和dna2，浓度都为100μm，该两种溶液分别用pbs缓冲液稀释至20μm；各取100μl相混合，混合后的溶液与10μl 100mm tris(2carboxyethyl)phosphine(tcep)混合，室温孵育1h；在溶液中加入5mlaunps，放置在摇床上，室温反应16h；向得到的反应液中加入500μl 0.1％sds，室温静置1h，500μl 0.1％sds，室温静置1h。
6、(3)反应过程将待测mirna(mir-34c-5p)、10×t4buffer、1u t4dna连接酶、1nmaunps-dsdna溶液和2u核糖核酸酶抑制剂混合，总体积为10μl；在65℃下孵育5min，25℃下孵育10min，便于目标mirna与dna探针杂交；然后加入t4dna连接酶，在37℃下孵育2h，完成连接反应；采用sybr greeni作为荧光染料，用2.5μl的连接产物进行后续的qpcr反应，可以通过监测系统中的ct值变化来确定mirna的存在和浓度。
7、所述步骤(1)中所有用于制备aunps的器皿都需经王水浸泡2h以上，再用大量超纯水彻底冲洗干净并烘干，需保证在制备过程中所使用的器皿和溶液不被污染。
8、所述步骤(2)中dna1的5’端修饰了巯基(-sh)，dna2的5’端修饰了磷酸基团(-p)，3’端修饰了巯基(-sh)，两者是通过巯基偶联在同一个纳米金颗粒上。
9、所述步骤(2)中dna1、dna2、目标mirna(mir-34c-5p)以及引物序列分别是
10、dna1:
11、5’-sh-ttttttttttttttttttttttttttttttgcagccaggcagtgtagttagcgcaatcagc-3’
12、dna2:
13、5’-p-taactacactgcctacctcggaccctgcactttttttttttttttttttttttttttttt-sh-3’
14、mirna(mir-34c-5p):5’-aggcaguguaguuagcugauugc-3’
15、正向引物：5’-gcagccaggcagtgtagttagc-3’
16、反向引物：5’-gtgcagggtccgaggt-3’。
17、本专利技术的有益效果是通过偶连在aunps上的探针的高邻近连接效率，实现了mirna的无逆转录、高灵敏度、高特异性检测。
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1.一种基于纳米金(AuNPs)和邻位连接(PLA)的miRNA检测方法，包括以下步骤：
2.按权利要求1所述的一种miRNA检测方法，其特征在于，所述的DNA1的5’端修饰了巯基(-SH)；DNA2的5’端修饰了磷酸基团(-P)，3’端修饰了巯基(-SH)，两者是通过巯基偶联在同一个纳米金颗粒上。
3.按权利要求1所述的一种miRNA检测方法，其特征在于，所述的DNA1、DNA2、目标miRNA(miR-34C-5P)以及引物序列分别是：
4.按权利要求1所述的一种miRNA检测方法，其特征在于，AuNPs-dsDNA溶液合成后，需离心去上清以去除多余的ssDNA。
5.按权利要求1所述的一种miRNA检测方法，其特征在于，去除多余的dsDNA后，将纳米金颗粒溶解于5mL PBS,(pH 7.4)中，在涡轮搅拌器上重悬1h，4℃避光保存备用。
6.按权利要求1所述的一种miRNA检测方法，其特征在于，最终反应系统中的Ct值与连接DNA扩增子量、连接效率以及相应较低的浓度成反比。
【技术特征摘要】
1.一种基于纳米金(aunps)和邻位连接(pla)的mirna检测方法，包括以下步骤：
2.按权利要求1所述的一种mirna检测方法，其特征在于，所述的dna1的5’端修饰了巯基(-sh)；dna2的5’端修饰了磷酸基团(-p)，3’端修饰了巯基(-sh)，两者是通过巯基偶联在同一个纳米金颗粒上。
3.按权利要求1所述的一种mirna检测方法，其特征在于，所述的dna1、dna2、目标mirna(mir-34c-5p)以及引物序列分别是：
...【专利技术属性】
技术研发人员：左国伟，叶紫芊，李珂宇，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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