【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸扩增及核酸检测，具体涉及一种可延长rt-qpcr线性扩增期的装置及其实现绝对定量分析检测初始dna模板在无标准曲线情况下以及精准矫正变化的pcr扩增效率。
技术介绍
1、将荧光报告分子引入pcr系统，实时监测扩增过程，即rt-qpcr(quantitativereal-time pcr)。rt-qpcr在dna的相对定量和绝对定量检测中有着广泛的应用，如遗传病的诊断、病原微生物的鉴定、靶基因的表达等。自20世纪90年代初higuchi等首次报道rt-qpcr以来，许多新的方法不断被专利技术来实现rt-qpcr的功能，例如环介导的等温扩增、重组酶聚合酶扩增、基于等温核酸扩增的微流控芯片和数字pcr。然而，rt-qpcr具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便等优点，是不可替代的。
2、taq dna聚合酶是rt-qpcr的核心组分，理论上可以将初始dna模板催化成指数扩增。不断增加的dna产物可以不断增强荧光信号强度。可变的荧光值被链接到rt-qpcr的扩增曲线中，扩增曲线包括四个主要阶段:基线期、早期指数期、对数线性期和平台期。taqdna聚合酶活性下降，dna产物增多，引物减少是导致扩增曲线变化的主要原因。因此，理论上对于不同初始模板数量的定量检测并不存在完全相同的rt-qpcr反应体系，例如每个体系的扩增效率和检测误差，当然是无法避免的。
3、无论绝对定量还是相对定量，pcr反应体系的扩增效率都是一个非常重要的因素，因为每根单独的pcr管中扩增效率的一致性是进行定量分析的前提。然而，
4、rt-qpcr的绝对定量离不开标准曲线。标准人工模板主要包含重组质粒dna、基因组dna、纯化pcr产物和纯化pcr产物寡核苷酸。至少五个rt-qpcr反应体系包含超过几个数量级的标准模板进行，以获得良好的标准曲线。已经测序的质粒非常适合生成标准曲线，但它们的制作既耗时又昂贵。寡核苷酸和pcr产物可以快速生产，并在不同的测定中提供灵活性，但它们的大小有限。pcr产物中可能存在未识别的序列错误，导致pcr扩增效率的变化。数字pcr可以在没有标准曲线的情况下进行绝对定量分析，但其设备极其昂贵且操作复杂。
技术实现思路
1、解决的技术问题：在本专利技术中，我们专利技术了一种含有牛血清白蛋白(bsa)凝胶的rt-qpcr装置，以控制牛血清白蛋白水凝胶中taq dna聚合酶的释放。当taq dnapolymerases的稳定数量与增加的pcr产物数量相等时，pcr的扩增效率基本保持不变。此时，它们的放大曲线显示出超过20个线性放大周期。该线性放大斜率与ct值呈明显的线性关系(r＝0.9445)，可以很好地解释放大效率的斜率。我们还发现，根据不同引物浓度的pcr反应体系的ct值与斜率之间的关系，扩增效率可以调整为均匀化。将牛血清白蛋白水凝胶引入rt-qpcr后，可以在不影响rt-qpcr扩增效率的前提下，使用更多的sybr green i来提高其dna检测的灵敏度。校正扩增变异后，我们可以准确计算rt-qpcr的扩增效率。最后，根据已知引物的数量和计算出的扩增效率，反向计算出dna模板的初始浓度。
2、技术方案：rt-qpcr装置用凝胶，含有牛血清白蛋白(bsa)。
3、牛血清白蛋白(bsa)凝胶在制备rt-qpcr装置中的应用。
4、含有牛血清白蛋白凝胶的rt-qpcr装置的构建方法，步骤为：配制牛血清白蛋白，再加入dna聚合酶、模板、引物、镁离子、pcr反应缓冲液和去离子水，所述终溶液中牛血清白蛋白浓度为10-40mg/ml；然后，高温热循环成胶制得rt-qpcr装置。
5、上述含有牛血清白蛋白凝胶的rt-qpcr装置的构建方法，具体步骤为：配制试剂：配制200mg/ml的bsa成胶溶液；配制20×pcr反应缓冲液：1000mm kcl，200mm ph 8.8tris-hcl，30mm mgcl2，1.6％(v/v)nonidet p40；dntp：2.5mm；上游引物：10mm；下游引物：10mm；dna聚合酶：1-5u taq dna聚合酶或热启动taq dna聚合酶；dna模板：cdna；构建装置：取0.5-2μl bsa溶液，1μl 20×pcr缓冲液，2μl mgcl2溶液，0.1μltaq dna聚合酶，1μl dntp，0.1-0.5μl上游引物10mm，0.1-0.5μl下游引物10mm，5μl dna模板，补充去离子水至20μl，混合后的液体置于pcr仪中95℃加热5min制得。
6、上述构建方法制得的rt-qpcr装置。
7、上述装置在精准矫正rt-qpcr变异的扩增效率中的应用。
8、上述装置在绝对定量分析在无标准曲线的情况下的应用。
9、有益效果：本专利技术制备含有bsa凝胶的rt-qpcr装置，控制释放taq dna聚合酶。首先，该装置的线性扩增周期可以持续10个以上热循环周期，其斜率与放大效率呈正相关(实施例1，2和3)。其次，引物的浓度变化可以调节该装置的扩增效率(实施例4)。第三，该装置可以在反应中加入更高浓度的sybr green i，提高其对dna的检测灵敏度。这些优点为矫正变化的扩增效率和无标准曲线的绝对定量分析提供一个平台(实施例5)。
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1.RT-qPCR装置用凝胶，其特征在于，含有牛血清白蛋白(BSA)。
2.牛血清白蛋白(BSA)凝胶在制备RT-qPCR装置中的应用。
3.含有牛血清白蛋白凝胶的RT-qPCR装置的构建方法，其特征在于，步骤为：配制牛血清白蛋白，再加入DNA聚合酶、模板、引物、镁离子、PCR反应缓冲液和去离子水，所述终溶液中牛血清白蛋白浓度为10-40 mg/mL；然后，高温热循环成胶制得RT-qPCR装置。
4.根据权利要求3所述含有牛血清白蛋白凝胶的RT-qPCR装置的构建方法，其特征在于，步骤为：
5.权利要求3或4所述构建方法制得的RT-qPCR装置。
6.权利要求5所述装置在精准矫正RT-qPCR变异的扩增效率中的应用。
7.权利要求5所述装置在绝对定量分析在无标准曲线的情况下的应用。
【技术特征摘要】
1.rt-qpcr装置用凝胶，其特征在于，含有牛血清白蛋白(bsa)。
2.牛血清白蛋白(bsa)凝胶在制备rt-qpcr装置中的应用。
3.含有牛血清白蛋白凝胶的rt-qpcr装置的构建方法，其特征在于，步骤为：配制牛血清白蛋白，再加入dna聚合酶、模板、引物、镁离子、pcr反应缓冲液和去离子水，所述终溶液中牛血清白蛋白浓度为10-40 mg/ml；然后...
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