本发明专利技术提供了一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法，涉及基因工程技术领域。将基因编辑载体进行酶切，得到酶切载体，与靶标序列连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌中和农杆菌中，得到转化菌，侵染橡胶树体胚等步骤得到橡胶树纯合基因编辑植株。本发明专利技术以基因编辑载体作为转化供体，通过对阳性抗性体胚的高通量测序判断其是否为嵌合体，T0代抗性体胚均为嵌合体。本发明专利技术通过对获得的T0代阳性嵌合体胚进行切胚纯化后继续继代，从而获得了T1代抗性体胚，T1代抗性体胚有约50％的比例达到了纯合，挑选这些T1代纯合编辑体胚进行植株再生，本发明专利技术首次获得了橡胶树纯合基因编辑植株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法。
技术介绍
1、现有的以橡胶树体胚为转化受体的遗传转化，转化后通过抗性愈伤诱导-抗性体胚形成的过程获得t0代抗性体胚，通过检测转化基因或抗性基因确定是否为阳性体胚，但这种方法只能检测抗性体胚是否含有转基因细胞，并不能判断该体胚中转基因细胞与非转化野生型细胞的比例，且获得的t0代阳性体胚均为嵌合体胚，由t0代阳性体胚获得的再生植株也均为嵌合植株，从而导致转基因功能失效，严重影响转基因功能判断的准确性。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法，本专利技术以pcambia1300-2×35scas9-hbu6.2载体(基因编辑载体)作为转化供体，区别于普通的功能基因过表达供体，因而可以通过对阳性抗性体胚的高通量测序判断其是否为嵌合体，结果证明，t0代抗性体胚均为嵌合体。最为关键的是，本专利技术通过对获得的t0代阳性嵌合体胚进行切胚纯化后继续继代，从而获得了t1代抗性体胚，经检测，t1代抗性体胚有约50％的比例达到了纯合，挑选这些t1代纯合编辑体胚进行植株再生，本专利技术首次获得了橡胶树纯合基因编辑植株。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法，包括以下步骤：
4、1)将pcambia1300-2×35scas9-hbu6.2载体进行酶切，得到酶切载体；
>5、所述pcambia1300-2×35scas9-hbu6.2载体的核苷酸序列如seq id no.9所示；6、2)将所述步骤1)得到的酶切载体与靶标序列连接，得到连接产物；
7、3)将所述步骤2)得到的连接产物转化到大肠杆菌中，提取质粒，将所述质粒转入到农杆菌中，得到转化菌；
8、4)将所述步骤3)得到的转化菌侵染橡胶树体胚，得到侵染体胚；
9、5)将所述步骤4)得到的侵染体胚切胚，得到胚块，将所述胚块进行愈伤组织诱导培养和体胚形成培养，筛选阳性转化体胚得到t0代体胚；
10、6)将所述步骤5)得到的t0代体胚切胚，得到胚块，将所述胚块进行愈伤组织诱导培养和体胚形成培养，得到t1代体胚，挑选纯合基因编辑体胚进行植株再生，得到橡胶树纯合基因编辑植株。
11、优选的，所述步骤2)靶标序列由引物对退火得到，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12、优选的，所述步骤2)连接的体系包括：酶切载体50ng、10×t4 ligase buffer1μl、靶标序列7μl、t4连接酶0.5μl，ddh2o补足至10μl；
13、所述连接的条件包括：在20～30℃下连接1h。
14、优选的，所述步骤1)酶切的体系包括：10×aari buffer 5μl、50×oligonucleotide 1μl、aari酶1μl、pcambia1300-2×35scas9-hbu6.2载体1μg，ddh2o补足至50μl；
15、所述酶切的条件包括：在37℃下酶切5h。
16、优选的，所述步骤5)和6)胚块的大小都为2～3mm×2～3mm。
17、优选的，所述步骤5)使用特异引物对筛选阳性转化体胚；
18、所述特异引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述特异引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
19、优选的，以体胚形成培养得到体胚的基因组dna为模板，经所述特异引物对进行pcr扩增，当扩增出433bp条带时，所述体胚为阳性转化体胚。
20、优选的，所述步骤3)农杆菌为农杆菌eha105；
21、所述步骤4)侵染的条件包括：在含有转化菌的菌液中添加乙酰丁香酮后，将橡胶树体胚置于菌液中静止孵育8min，超声处理后，再静止孵育10min。
22、优选的，所述超声处理的条件包括：在40khz下处理50s。
23、优选的，所述步骤5)和6)愈伤组织诱导培养的条件都包括：在含有3.0mm氯化钙、7.0μm kt、8.1μm萘乙酸、6.8μm 2,4-d、204.5mm蔗糖、2.2g/l植酸酶、10mg/l潮霉素和500mg/l timentin的ms愈伤组织诱导培养基上暗培养30d，所述暗培养的温度为24℃；
24、所述步骤5)和6)体胚形成培养的条件都包括：将萌发的愈伤组织转移到含有10mg/l潮霉素的体胚形成培养基中培养2个月。
25、本专利技术的有益效果为：
26、本专利技术以基因编辑载体作为转化供体，区别于普通的功能基因供体，因而可以通过对阳性抗性体胚的高通量测序判断其是否为嵌合体，结果证明，t0代抗性体胚均为嵌合体。最为关键的是，本专利技术通过对获得的t0代阳性嵌合体胚进行切胚纯化后继续继代，从而获得了t1代抗性体胚，经检测，t1代抗性体胚有约50％的比例达到了纯合，挑选这些t1代纯合编辑体胚进行植株再生，本专利技术首次获得了橡胶树纯合基因编辑植株。
27、本专利技术使用基因编辑载体作为转化供体，可以对阳性体胚中的转基因细胞比列和类型进行分类。因为基因编辑载体对靶标基因hbpds基因编辑后，通过对靶点处的序列进行高通量测序，可以把阳性体胚分为以下4中类型：一是只含有野生型细胞的未突变类型；二是同时存在野生型和突变型的嵌合体；三是只包含多种突变类型的嵌合体；四是纯合基因编辑转化子。
28、本专利技术在获得t0代阳性转化体胚后，并不像常规转化一样进入植株再生程序，而是对t0代体胚再进行一轮切胚-抗性愈伤诱导-抗性体胚形成的抗性继代筛选过程，从而获得的t1代阳性体胚中有接近50％的纯合体胚，挑选纯合基因编辑体胚进行植株再生，从而首次获得橡胶树纯合基因编辑植株。
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【技术保护点】
1.一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)靶标序列由引物对退火得到，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)连接的体系包括：酶切载体50ng、10×T4 ligase buffer 1μL、靶标序列7μL、T4连接酶0.5μL，ddH2O补足至10μL；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)酶切的体系包括：10×AarIbuffer 5μL、50×oligonucleotide 1μL、AarI酶1μL、pCAMBIA1300-2×35SCas9-HbU6.2载体1μg，ddH2O补足至50μL；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)和6)胚块的大小都为2～3mm×2～3mm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)使用特异引物对筛选阳性转化体胚；p>
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以体胚形成培养得到体胚的基因组DNA为模板，经所述特异引物对进行PCR扩增，当扩增出433bp条带时，所述体胚为阳性转化体胚。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)农杆菌为农杆菌EHA105；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述超声处理的条件包括：在40kHz下处理50s。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)和6)愈伤组织诱导培养的条件都包括：在含有3.0mM氯化钙、7.0μM KT、8.1μM萘乙酸、6.8μM 2,4-D、204.5mM蔗糖、2.2g/L植酸酶、10mg/L潮霉素和500mg/Ltimentin的MS愈伤组织诱导培养基上暗培养30d，所述暗培养的温度为24℃；
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【技术特征摘要】
1.一种获得橡胶树纯合基因编辑植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)靶标序列由引物对退火得到，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)连接的体系包括：酶切载体50ng、10×t4 ligase buffer 1μl、靶标序列7μl、t4连接酶0.5μl，ddh2o补足至10μl；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)酶切的体系包括：10×aaribuffer 5μl、50×oligonucleotide 1μl、aari酶1μl、pcambia1300-2×35scas9-hbu6.2载体1μg，ddh2o补足至50μl；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)和6)胚块的大...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨先锋，林秋飞，吉努·乌达亚巴努，黄天带，顾晓川，邓玉婷，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：
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