【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞工程领域，具体涉及一种内侧神经节隆起（mge）细胞的制备方法与给药前处理方法。
技术介绍
1、神经退行性疾病是长期存在的疾病，会导致神经细胞的持续退化或死亡。其中，多种疾病与大脑内神经兴奋和抑制失衡相关，具体表现为大脑内部的兴奋性神经元过度激活，抑制性神经元（如gaba能中间神经元）被抑制。
2、mge又称之为内侧神经节突起，其于胚胎期产生于端脑腹侧，会逐渐迁移到发育中的新皮层、海马和嗅球，并在那里生成如胆碱能神经元、多种gaba 能中间神经元，如小清蛋白中间神经元（parvalbumin, pv）、生长抑制素中间神经元（somatostatin, sst）等。
3、进行mge细胞移植可以修复这类大脑内部的兴奋性神经元被过度激活，抑制性神经元（如gaba能中间神经元）被抑制的病人大脑的神经回路，移植的细胞进一步分化成抑制性中间神经元，进而可以治疗神经元异常过度兴奋导致的疾病，如唐氏综合症、孤独症、精神分裂症、癫痫。
4、传统制备mge细胞多是从流产胎儿的脑组织中提取制备，这会带来伦理上的巨大挑战；此外，本类细胞一直无法有效解决体外扩增的难题，在体外扩增时，会很容易失去分化潜能，同时也会丧失其表型。而多能干细胞（psc）具有很强的自我更新和分化能力，是一种有前途的干细胞替代来源。人诱导多能干细胞（ipsc）是从成人体细胞人工诱导的多能干细胞，具备与胚胎干细胞同等的分化潜能，可以在体外诱导成多种不同的目标细胞，克服了与使用胚胎干细胞相关的伦理问题。
技
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种内侧神经节隆起（mge）细胞的制备方法，以及一种用于制备mge细胞的培养基及其应用；本专利技术的目的还在于提供一种mge细胞的给药前处理方法。
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、本专利技术提供了一种用于制备mge细胞的培养基，其包含基础培养基和以下成分：n2添加剂、glutamax添加剂、purmorphamine、egf（表皮生长因子）、bfgf（碱性成纤维细胞生长因子）、dorsomorphin、sonic hedgehog（shh）、chir99021。所述的基础培养基优选为商业化神经元培养基中的一种或多种的混合；或所述的基础培养基优选为商业化神经元培养基中的一种或多种与dmem/f12混合的培养基；所述的商业化神经元培养基包括thermofisher、brainphys等公司的神经元培养基，如neurobasala培养基、neurobasal培养基、brainphys™培养基等。
4、优选的，所述的制备mge细胞的培养基包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的n2添加剂，终浓度1×的glutamax添加剂，1-20μm的purmorphamine，1-100ng/ml的egf，1-100ng/ml的bfgf，0.2-100μm的dorsomorphin，2-500ng/ml的shh，0.2-20μm的chir99021。
5、优选的，所述的制备mge细胞的培养基包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的n2添加剂，终浓度1×的glutamax添加剂，1-5μm的purmorphamine，1-20ng/ml的egf，1-20ng/ml的bfgf，0.2-10μm的dorsomorphin，10-500ng/ml的shh，0.2-6μm的chir99021。
6、优选的，所述的制备mge细胞的培养基包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的n2添加剂，终浓度1×的glutamax添加剂，2μm的purmorphamine，5ng/ml的egf， 10ng/ml的bfgf，2μm的dorsomorphin，100ng/ml的shh，3μm的chir99021。
7、本专利技术还提供了上述制备mge细胞的培养基在对mge细胞培养中的应用。
8、本专利技术还提供了一种mge细胞的制备方法，其包括如下步骤：使用上述制备mge细胞的培养基对mge细胞进行扩增培养。
9、所述的mge细胞的制备方法中，mge细胞的来源不受限制，可为从人胚胎或脑组织中直接分离得到，可为通过人多能干细胞ipsc诱导分化得到，也可为胚胎多能干细胞esc诱导分化得到。
10、在一些实施方案中，所述的mge细胞通过包括如下步骤的方法获得：
11、（1）第0-1天，使用含y27632的ipsc培养基对ipsc进行培养。
12、（2）第2-11天，使用神经诱导培养基进行培养。所述的神经诱导培养基包含以下成分：含knockout血清替代物（knockout serum replacement, kosr）、glutamax添加剂、dorsomorphin、sb431542、xav939、purmorphamine。
13、（3）第12-18天，使用mge形成培养基进行培养，得到mge细胞。所述的mge形成培养基包含以下成分：b27添加剂（不含va）、glutamax添加剂、purmorphamine。
14、步骤（1）中，所述的y27632的浓度优选为5-15μm，进一步优选为10μm；所述的ipsc培养基优选为mtesr1、e8等商业化的ipsc培养基。
15、步骤（2）中，所述的神经诱导培养基优选为以dmem/f12为基础培养基，包含以下浓度的成分：5-20%（体积百分含量）的kosr，终浓度1×的glutamax添加剂，1-10μm的dorsomorphin，5-15μm的sb431542，1-3μm的xav939，0.5-5μm的purmorphamine。进一步地，所述的神经诱导培养基以dmem/f12为基础培养基，包含以下浓度的成分：15%的kosr，终浓度1×的glutamax添加剂，5μm的dorsomorphin，10μm的sb431542，2μm的xav939，1μm的purmorphamine。
16、步骤（3）中，所述的mge形成培养基优选以上述制备mge细胞的培养基中的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的b27添加剂（不含va），终浓度1×的glutamax添加剂，0.5-5μm的purmorphamine。进一步地，所述的mge形成培养基以上述制备mge细胞的培养基中的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的b27添加剂（不含va），终浓度1×的glutamax添加剂，1μm的purmorphamine。
17、本专利技术中所涉及的各培养基中还可加入终浓度1×的p/s（双抗），以避免污染。
18、本专利技术还提供了一种mge细胞的给药前处理方法，其包括如下步骤：将通过上述制备方法扩增得到的mge细胞接入到给药前处理培养基中在aggrewell™培养板中培养24h-72h，使mge细胞成微球。所述的给药前处理培养基包含以下成分：n2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于制备MGE细胞的培养基，其特征在于：包含基础培养基和以下成分：N2添加剂、GlutaMAX添加剂、Purmorphamine、EGF、bFGF、Dorsomorphin、SHH、CHIR99021。
2.根据权利要求1所述的用于制备MGE细胞的培养基，其特征在于：所述的基础培养基为商业化神经元培养基中的一种或多种的混合，或所述的基础培养基为商业化神经元培养基中的一种或多种与DMEM/F12混合的培养基；所述的商业化神经元培养基包括NeurobasalA培养基、Neurobasal培养基、BrainPhys™培养基。
3.根据权利要求1所述的用于制备MGE细胞的培养基，其特征在于：包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，终浓度1×的GlutaMAX添加剂，1-20μM的Purmorphamine，1-100ng/mL的EGF，1-100ng/mL的bFGF，0.2-100μM的Dorsomorphin，2-500ng/mL的SHH，0.2-20μM的CHIR99021。
4.根据权利要求1所述的用于制备MGE细胞的培养
5.权利要求1-4任一项所述的用于制备MGE细胞的培养基在对MGE细胞培养中的应用。
6.一种MGE细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：使用权利要求1-4任一项所述的用于制备MGE细胞的培养基对MGE细胞进行扩增培养；
7.根据权利要求6所述的MGE细胞的制备方法，其特征在于：所述的MGE细胞通过包括如下步骤的方法获得：
8.根据权利要求7所述的MGE细胞的制备方法，其特征在于：
9.一种MGE细胞的给药前处理方法，其特征在于：包括如下步骤：将通过权利要求6-8任一项所述的制备方法扩增得到的MGE细胞接入到给药前处理培养基中在AggreWellTM培养板中培养，使MGE细胞成微球；
10.根据权利要求9所述的MGE细胞的给药前处理方法，其特征在于：所述的给药前处理培养基以权利要求2中所述的基础培养基为基础培养基，包含以下浓度的成分：终浓度1×的N2添加剂，0.5-50μM的DAPT，2-200ng/mL的BDNF，2-200g/mL的NGF。
...【技术特征摘要】
1.一种用于制备mge细胞的培养基，其特征在于：包含基础培养基和以下成分：n2添加剂、glutamax添加剂、purmorphamine、egf、bfgf、dorsomorphin、shh、chir99021。
2.根据权利要求1所述的用于制备mge细胞的培养基，其特征在于：所述的基础培养基为商业化神经元培养基中的一种或多种的混合，或所述的基础培养基为商业化神经元培养基中的一种或多种与dmem/f12混合的培养基；所述的商业化神经元培养基包括neurobasala培养基、neurobasal培养基、brainphys™培养基。
3.根据权利要求1所述的用于制备mge细胞的培养基，其特征在于：包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的n2添加剂，终浓度1×的glutamax添加剂，1-20μm的purmorphamine，1-100ng/ml的egf，1-100ng/ml的bfgf，0.2-100μm的dorsomorphin，2-500ng/ml的shh，0.2-20μm的chir99021。
4.根据权利要求1所述的用于制备mge细胞的培养基，其特征在于：包含基础培养基和以下浓度的成分：终浓度1×的n2添加剂，终浓度1×的glutamax添加剂，2...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳青，张学，王高杰，张信哲，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：
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