【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种用于可溶性蛋白高密度发酵的补料培养基及其应用。
技术介绍
1、高密度发酵技术可以提高菌体的发酵密度，提高产物的比生产率，不但可相应减少发酵规模和生产批次，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，从而大大提高产品竞争力。为了获得高效表达的重组菌株，表达系统的构建是成功的关键。在构建重组菌时，宿主菌和载体的选择、偏爱密码子和启动子的选择、质粒拷贝数等都需全面考虑。要实现高密度发酵，除了基于工程菌自身的表达特性外，还必须筛选出适宜其生长和目的蛋白表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组分、发酵控制条件、补料策略等。
2、中国专利申请202311058119.x公开了一种提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法。所述方法先将表达重组人源胶原蛋白的巴斯德毕赤酵母pichia pastoris jy0201高密度发酵液离心，获得的高密度菌液稀释后，加入促溶剂，调节ph为5-7，控制罐压为0.15-0.2mpa，并加热裂解，得到的自溶菌体混悬液经低温高速离心获得上清液，最后除菌过滤，得到巴斯德毕赤酵母提取液。
3、中国专利申请202311240145.4公开了一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法，所述方法包括：将解脂耶氏酵母菌种接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵，所述高密度发酵的过程中补加乙酸和氮源，得到所述单细胞蛋白；所述种子培养基的碳源包括第一乙酸盐，所述发酵培养基的碳源包括第二乙酸盐和/或酮类化合物。
4、目前本
技术实现思路
1、为了实现上述技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
2、本专利技术的目的之一，在于提供一种用于可溶性蛋白高密度发酵的补料培养基，所述补料培养基包括：
3、葡萄糖，蛋白胨和磷酸氢二钾；
4、所述补料培养基不含镁元素和/或镁离子。
5、在一些实施方式中，所述补料培养基包括：
6、葡萄糖500-900g/l，蛋白胨2.0-5.0g/l和磷酸氢二钾2.0-5.0g/l。
7、在一些优选的实施方式中，所述补料培养基包括：
8、葡萄糖600-800g/l，蛋白胨3.0-4.0g/l和磷酸氢二钾3.0-4.0g/l。
9、本专利技术的目的之二，在于提供一种用于可溶性蛋白高密度发酵的培养基组合，所述培养基组合包括：
10、(1)发酵培养基；
11、(2)前述任一补料培养基；
12、所述发酵培养基包括：
13、硫酸镁，柠檬酸钠，磷酸氢二钾，磷酸氢二铵，酵母粉，微量元素，葡萄糖和消泡剂。
14、在一些实施方式中，所述发酵培养基不包含蛋白胨。
15、在一些实施方式中，所述发酵培养基包括：
16、硫酸镁2.0-3.0g/l，柠檬酸钠2.0-4.0g/l，磷酸氢二钾4.0-6.0g/l，酵母粉15.0-25.0g/l，微量元素6.0-8.0ml/l，葡萄糖9.0-11.0g/l和消泡剂0.1-1.0ml/l。
17、在一些优选的实施方式中，所述发酵培养基包括：
18、硫酸镁2.5g/l，柠檬酸钠3.0g/l，磷酸氢二钾5.0g/l，酵母粉10.0g/l，微量元素7.0ml/l，葡萄糖10.0g/l和消泡剂0.5ml/l。
19、在一些实施方式中，每1l微量元素中包含：
20、七水硫酸亚铁16.8g，七水硫酸锌4.2g，七水硫酸镁0.8g，二水钼酸钠1.3g，五水硫酸铜0.6g，硼酸1.8g和磷酸48.0ml。
21、本专利技术的目的之三，在于提供前述任一补料培养基或前述任一培养基组合在高密度发酵可溶性蛋白中的应用。
22、在一些实施方式中，所述可溶性蛋白包括，但不限于肉毒素。
23、本专利技术的目的之四，在于提供一种利用前述任一补料培养基或前述任一培养基组合高密度发酵可溶性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
24、1)将目的菌株的培养物接种至装有所述发酵培养基的发酵罐进行发酵培养，当培养溶氧反弹至45％以上时加入补料培养基；
25、2)当发酵液的od600达到55-65，温度为18-25℃，停止补料溶氧快速上升后，加入诱导剂进行诱导；
26、3)诱导结束后，破裂菌体，即得可溶性蛋白。
27、在一些实施方式中，步骤1)中所述培养物的接种量为2％-4％。
28、在一些实施方式中，步骤3)中所述诱导的温度为18-20℃，优选20℃。
29、在一些实施方式中，步骤1)中所述发酵培养包括以下至少一种条件：
30、(ⅰ)溶氧为15％-50％；
31、(ⅱ)培养温度为36-38℃；
32、(ⅲ)转速为150-700rpm；
33、(ⅳ)ph为6.4-7.4。
34、在一些实施方式中，当溶氧受限时，培养温度可降低至28-33℃。
35、在一些实施方式中，步骤1)中所述发酵培养保持残糖不大于1g/l。
36、在一些实施方式中，步骤1)中所述补料培养基的添加方式：
37、开始时补料速度为4.0ml/m，之后每经过半小时增加0.5ml/m递增补料，od600达到55-65开始降温，开始降温后不再增加补料，降温至18-25℃后补料速率降低1ml/m，维持2-3h后以0.25ml/m递增补料。
38、本专利技术的递增补料是指，在初始补料速度4.0ml/m的基础上，每经过半小时增加0.5ml/m，即一开始补料速度为4ml/m，半小时后为4.5ml/m，一小时后为5.0ml/m，一个半小时后为5.5ml/m，以此类推。本领域技术人员可根据上述定义理解、实施本专利技术。
39、本专利技术中的ml/m是指每分钟(m，min)添加的补料培养基的体积(ml)。
40、在一些实施方式中，所述诱导剂可以为0.1-0.4mm iptg。
41、在一些实施方式中，所述可溶性蛋白包括，但不限于肉毒素。
42、本专利技术提供的高密度发酵目的蛋白的方法，不仅筛选出了补料培养基的最佳组分及含量，还优化了发酵过程中的诸多参数，例如溶氧、发酵时长、诱导时间和残糖浓度等，显著降低了发酵产生的乙酸含量，从而为菌体生长创造了有利条件，最终实现了目的蛋白的高密度发酵，灰度值最高可达21177。本专利技术的方法兼容各种体积的发酵，在500l放大发酵中也取得了较佳的效果，在工业化生产中前景广阔。
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1.一种用于可溶性蛋白高密度发酵的补料培养基，其特征在于，所述补料培养基包括：
2.根据权利要求1所述的补料培养基，其特征在于，所述补料培养基包括：
3.一种用于可溶性蛋白高密度发酵的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合包括：
4.根据权利要求3所述的培养基组合，其特征在于，所述发酵培养基包括：
5.根据权利要求1-2中任一所述的补料培养基或权利要求3-4中任一所述的培养基组合在高密度发酵可溶性蛋白中的应用。
6.一种利用权利要求1-2中任一所述的补料培养基或权利要求3-4中任一所述的培养基组合高密度发酵可溶性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述诱导的温度为18-20℃，优选20℃。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述发酵培养包括以下至少一种条件：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述发酵培养保持残糖不大于1g/L。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征
...【技术特征摘要】
1.一种用于可溶性蛋白高密度发酵的补料培养基，其特征在于，所述补料培养基包括：
2.根据权利要求1所述的补料培养基，其特征在于，所述补料培养基包括：
3.一种用于可溶性蛋白高密度发酵的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合包括：
4.根据权利要求3所述的培养基组合，其特征在于，所述发酵培养基包括：
5.根据权利要求1-2中任一所述的补料培养基或权利要求3-4中任一所述的培养基组合在高密度发酵可溶性蛋白中的应用。
6.一种利用权利要求1-2中任一所述的补料...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝威，张佳生，张文韬，祝汉起，孙自越，宁子萱，郭文，蒋睿峰，
申请(专利权)人：河北平朴生物科技合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：
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