【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种全细胞生物催化制备组胺的方法，具体涉及一种酶促反应制备组胺的方法。
技术介绍
1、组胺(histamine)是生物胺的一种，是动物、植物、多数微生物体内一种重要的活性物质，主要由l-组氨酸经组氨酸脱羧酶(hdc)催化脱羧生成。组胺与人的炎症反应、过敏反应、免疫反应等多种生理反应相关。对组胺的研究表明，组胺盐具有一定的药用价值，其磷酸盐可用于临床胃液分泌功能的检查和麻风病的辅助诊断。此外，磷酸组胺、地塞米松联合咪喹莫特治疗血管瘤具有很好的效果，并能减少其不良反应。
2、目前，组胺以二盐酸组胺注射剂被美国fda授予药资，作为佐剂治疗恶性黑色素瘤和多种肿瘤，已经在欧盟27个成员国上市。il-2可以激活t/nk效应细胞发挥抗肿瘤的作用，早被用于肿瘤的治疗，但当有反应性氧化代谢物存在时，单用il-2治疗效果不显著，而组胺可抑制反应性氧化代谢物生成，因此以组胺作为佐剂可增加il-2治疗肿瘤效果。2008年epicept公司开发抗肿瘤药二盐酸组胺与低剂量il-2联用用于预防性治疗急性骨髓性白血病。另外，研究表明，将地塞米松、磷酸组胺以及咪喹莫特联合用于治疗小鼠血管瘤时，发现治疗的有效率为94.1％，并减少了咪喹莫特的副作用。徐颖等人观察磷酸组胺对治疗皮肤划痕症影响的实验中，发现磷酸组胺对机体氧化-抗氧化具有改善作用。
3、组胺的合成通常以廉价的组氨酸为原料，经过脱羧反应制备组胺，如最早期以2-环己烯-1-酮为催化剂，160℃脱羧，但该方法需要高温160℃，并且最终产物未知杂质多，无法满足生产所需。cn
4、利用生物催化法合成组胺，目标反应式如下所示，以l-组氨酸为底物，组氨酸脱羧酶作为催化剂，可以直接将组氨酸转化为组胺，无中间体产物，可减少操作步骤，有利于成本的降低。由于组氨酸脱羧酶具有专一性，作用条件温和等特性。所以该反应可在温和条件下进行，产物单一，同时减少了操作的危险性和化学试剂带来的环境污染。
5、
6、为了使用更绿色环保的方法制备组胺，本专利技术使用反应条件温和、对环境友好的生物酶法制备组胺，为组胺的生物酶法合成奠定了基础。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种全细胞生物催化制备组胺的方法，该方法解决了现有化学方法污染严重，副产物较多的问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种组氨酸脱羧酶的表达质粒，所述表达质粒的载体为pet-28a质粒、pacycduet-sfp质粒或ptrc-p99a质粒，所述组氨酸脱羧酶的氨基酸序列如seq id no：2所示；
4、所述pacycduet-sfp质粒按如下方法构建:
5、利用引物对bsusfp-f和bsusfp-r对枯草芽孢杆菌的基因组进行pcr扩增，得到bsusfp基因；
6、bsusfp-f 5’-3’:accatcatcaccacagccag atgaagatttacggaatttatatgga
7、bsusfp-r 5’-3’:gtggcagcagcctaggttaa ttataaaagctcttcgtacgagacc利用引物对pacyc-f和pacyc-r对pacycduet-1质粒进行反向pcr，得到线性化pacycduet-1质粒；
8、pacyc-f 5’-3’:ttaacctaggctgctgccac
9、pacyc-r 5’-3’:ctggctgtggtgatgatggt
10、利用一步克隆试剂盒(clonexpress iione step cloning kit)将所述bsusfp基因和所述线性化pacycduet-1质粒连接，获得所述pacycduet-sfp质粒。
11、优选地，所述载体为pacycduet-sfp质粒。
12、进一步，所述组氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
13、在本专利技术的一个实施例中，所述载体为pet-28a质粒，所述重组质粒是将seq idno：1所示核苷酸序列插入质粒pet28a的ecorⅰ酶切位点和hindⅲ酶切位点之间得到。
14、在本专利技术的一个实施例中，所述载体为pacycduet-sfp质粒，所述重组质粒如如下方法构建：
15、将seq id no：1所示核苷酸序列插入质粒pet28a的ecorⅰ酶切位点和hindⅲ酶切位点之间，得到重组质粒pet-28a-hdc；
16、利用引物对hdc-f、hdc-r对所述重组质粒pet-28a-hdc进行pcr扩增，得到hdc插入片段；
17、hdc-f 5’-3’ catcaccacagccaggaattcatgaccctgagcatt
18、hdc-r5’-3’ agcagcctaggttaaaagctttgctgcaatggttt
19、利用引物对pacyc-f、pacyc-r对pacycduet-sfp质粒进行反向pcr，得到线性化pacycduet质粒；
20、pacyc-f5’-3’attgcagcaaagctt ttaacctaggctgctgccac
21、pacyc-r5’-3’cagggtcatgaattc ctggctgtggtgatgatggt
22、利用一步克隆试剂盒(clonexpress iione step cloning kit)将所述hdc插入片段和所述线性化pacycduet质粒连接，获得所述重组质粒。
23、在本专利技术的一个实施例中，所述载体为ptrc-p99a质粒，所述重组质粒如如下方法构建：
24、将seq id no：1所示核苷酸序列插入质粒pet28a的ecorⅰ酶切位点和hindⅲ酶切位点之间，得到重组质粒p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述表达质粒的载体为pET-28a质粒、pACYCDuet-sfp质粒或pTrc-p99A质粒，所述组氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
2.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述载体为pACYCDuet-sfp质粒。
3.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述组氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述载体为pET-28a质粒，所述重组质粒是将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列插入质粒pET28a的EcoRⅠ酶切位点和HindⅢ酶切位点之间得到。
5.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述载体为pACYCDuet-sfp质粒，所述重组质粒如如下方法构建：
6.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述载体为pTrc-p99A质粒，所述重组质粒如如下方法构建：
7.如权利要求1所述的组氨酸
8.如权利要求7所述的重组基因工程菌，其特征在于：当所述重组质粒的载体是pET-28a质粒或pACYCDuet-sfp质粒时，所述重组基因工程菌的宿主为E.coli BL21(DE3)；当所述重组质粒的载体是pTrc-p99A质粒时，所述重组基因工程菌的宿主为E.coli BL21(DE3)或E.coli W3110。
9.如权利要求7所述的重组基因工程菌在生物酶法制备组胺中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用为：
...【技术特征摘要】
1.一种组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述表达质粒的载体为pet-28a质粒、pacycduet-sfp质粒或ptrc-p99a质粒，所述组氨酸脱羧酶的氨基酸序列如seq id no：2所示；
2.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述载体为pacycduet-sfp质粒。
3.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述组氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
4.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述载体为pet-28a质粒，所述重组质粒是将seq id no：1所示核苷酸序列插入质粒pet28a的ecorⅰ酶切位点和hindⅲ酶切位点之间得到。
5.如权利要求1所述的组氨酸脱羧酶的表达质粒，其特征在于：所述载体为pa...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，戚凤杰，赵嫚，俞梦莹，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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