【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及利用抗性突变基因提高哈茨木霉对dmi类杀菌剂耐受性的方法。
技术介绍
1、植物真菌病害是植物生长过程中最为普遍的一类病害，每年可为农业生产造成严重的经济损失。对于植物真菌病害的防治，目前仍以化学杀菌剂的使用为主。其中，甾醇脱甲基抑制剂类(dmi)杀菌剂是一类广谱性真菌抑制剂，在植物真菌病害防治过程中发挥着不容忽视的作用。该类杀菌剂通过抑制真菌体内甾醇14α-脱甲基酶(cyp51)的活性阻断麦角甾醇合成过程，从而抑制真菌生长。dmi类杀菌剂在化学结构上主要包括三唑类、咪唑类、哌嗪类等，其中以三唑类杀菌剂种类最多，应用最为广泛。自上个世纪70年代首个三唑类杀菌剂三唑酮问世以来，不断有新型dmi类杀菌剂被开发登记，包括三唑醇、双苯三唑醇、氟环唑、丙环唑、氟硅唑、戊唑醇、腈菌唑、烯唑醇等。大多dmi类杀菌剂具有高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强、杀菌谱广等优点，因而，该类杀菌剂在农业生产中一直备受消费者青睐，在杀菌剂销售份额中占据很高的比重。
2、近年来，生物防治在农业中的应用越来越普遍。自然界中蕴藏着丰富的生防菌资源，其中，木霉属真菌表现出了很高的应用价值。哈茨木霉(trichoderma harzianum)是一种重要的生防真菌，可用于在多种植物病害的生物防治。例如，以哈茨木霉t-22菌株为有效成分的产品已被开发登记为多种微生物杀菌剂，且对多种重要植物真菌病害表现出了良好的防治效果。根据已有报道，哈茨木霉发挥生防作用的机制是多样化的，包括重寄生、产抗生素、对养分和/或空间的竞争、提高植物对
3、化学防治具有成本低、见效快、效率高、适用范围广等优点，在农业生产中发挥着不可替代的作用。然而，一些化学杀菌剂的大量使用，很可能导致农产品农药残留超标，威胁人类健康；有些杀菌剂由于在环境中半衰期长，容易造成环境污染等问题；另外，一些杀菌剂由于不合理使用，使病原菌产生了严重的抗药性，致使病害的化学防治更加困难。以活体微生物为有效成分的生物杀菌剂的优点是安全性高，环境兼容性好，但是其在生产中容易受到外界环境因素的影响，病害防控效果稳定性难以得到保障；且生物防治往往见效较慢，对于大规模流行性病害难以起到理想的防控效果。因此，在实际生产中需要综合利用多种措施防治植物病害。然而，由于dmi类杀菌剂对哈茨木霉有强烈的抑制作用，导致以哈茨木霉为主体的生物防治方法与以dmi类杀菌剂为主体的化学防治策略不能兼容。提高哈茨木霉对dmi类杀菌剂的耐受性，可以有效解决此问题。
4、dmi类杀菌剂在真菌体内的作用靶标是甾醇合成途径中的14α-脱甲基酶(cyp51)，该蛋白的氨基酸突变可以导致药剂与靶标亲和力下降，从而使病原菌产生抗药性。根据已有报道，病原真菌体内cyp51蛋白多种类型的氨基酸突变均可导致病原菌产生抗药，其中，禾生球腔菌(mycosphaerella graminicola)体内的cyp51蛋白(mgcyp51)可发生多个氨基酸位点的联合突变(l50s，s188n，i381v，δy459/g460，n513k)，突变蛋白的编码基因为抗性突变基因，该基因在禾生球腔菌体内的过量表达可以使病原菌对多个dmi类杀菌剂同时产生较高水平的抗药性。本专利技术依据木霉基因组信息将此抗性基因进行密码子优化，将优化后的抗性基因(cyp51-r)连入真菌表达载体并转入哈茨木霉，获得了哈茨木霉dmi耐药性菌株，构建了一种提高哈茨木霉对dmi类杀菌剂耐药性的方法。
5、目前，提高哈茨木霉菌株对杀菌剂耐药性多采于紫外诱导及药剂驯化等方法。但这些方法存在周期长、工作量大等缺点，且有时获得的突变体菌株抗性不稳定、生存适合度低，不利于实际生产中的应用。
技术实现思路
1、本专利技术提出利用抗性突变基因提高哈茨木霉对dmi类杀菌剂耐受性的方法，目的是为了解决传统技术中哈茨木霉对dmi类杀菌剂敏感性高、二者在植物病害防治过程中不能兼容的问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、抗性突变基因提高哈茨木霉对dmi类杀菌剂耐受性的方法，包括以下步骤：
4、(1)获得目的基因；
5、(2)将目的基因连入表达载体，得到重组载体；
6、(3)将重组载体转化转入哈茨木霉菌株，在哈茨木霉菌株中异源表达优化后的禾生球腔菌的抗性突变基因，获得了哈茨木霉dmi耐药性菌株。
7、其中：步骤(1)所述的目的基因为抗性突变基因(cyp51-r)；制备方法为：
8、①获取禾生球腔菌dmi敏感菌株cyp51蛋白序列及其对应的cds序列，通过氨基酸替换和删除将多个位点联合突变(l50s，s188n，i381v，δy459/g460，n513k)引入蛋白序列；
9、②根据木霉属真菌基因组信息对抗性突变蛋白的密码子进行优化，获得对应的抗性突变基因(cyp51-r)序列，通过基因合成的方法获得该抗性突变基因。
10、其中：步骤(2)所述的表达载体为真菌表达载体pxeh，步骤(2)所述的重组载体为带有抗性突变基因(cyp51-r)的载体(pxeh-cyp51-r)，步骤(2)中是将抗性突变基因(cyp51-r)通过in-fusion连接引入真菌表达载体pxeh构成重组载体(pxeh-cyp51-r)，制备方法为：
11、①利用限制性内切酶aatii/hindiii将载体pxeh线性化，并切除载体上携带的潮霉素抗性基因，利用商业化的胶回收试剂盒回收线性化载体片段；
12、②以抗性突变基因(cyp51-r)为模板，设计引物，利用高保真酶fastpfu mix扩增该基因片段，扩增引物为mgcyp-f1和mgcyp-r1，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；
13、③利用商品化in-fusion hd重组酶将步骤①和步骤②获得的胶回收产物连接，从而将抗性突变基因连入表达载体，获得带有抗性突变基因(cyp51-r)的载体(pxeh-cyp51-r)；
14、④利用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，涂于含卡那霉素的lb固体培养基平板，通过菌落pcr获得阳性菌落，经测序验证后，于含有卡那霉素的lb液体培养基过夜摇培，并利用商业化的试剂盒小量提取质粒。
15、其中：步骤(3)所述转化、培养和筛选方法为：
16、①带有抗性突变基因(cyp51-r)的载体(pxeh-cyp51-r)转化至农杆菌agl-1菌株，通过菌落pcr及产物测序获得阳性农杆菌转化子；
17、②将含有载体(pxeh-cyp51-r)的农杆菌转化子接种于液体lb培养基，28℃条件下摇培2天，离心并收集菌体，用mm液体培养基悬浮菌体，继续摇培4小时，将菌液od600调节至0.8左右；
18、③将哈茨木霉t-22菌株本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用抗性突变基因提高哈茨木霉对DMI类杀菌剂耐受性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用抗性突变基因提高哈茨木霉对DMI类杀菌剂耐受性的方法，其特征在于，其中：
3.根据权利要求1所述的利用抗性突变基因提高哈茨木霉对DMI类杀菌剂耐受性的方法，其特征在于，其中：
4.根据权利要求1所述的利用抗性突变基因提高哈茨木霉对DMI类杀菌剂耐受性的方法，其特征在于，其中：
5.根据权利要求4所述的利用抗性突变基因提高哈茨木霉对DMI类杀菌剂耐受性的方法，其特征在于，其中：
【技术特征摘要】
1.利用抗性突变基因提高哈茨木霉对dmi类杀菌剂耐受性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用抗性突变基因提高哈茨木霉对dmi类杀菌剂耐受性的方法，其特征在于，其中：
3.根据权利要求1所述的利用抗性突变基因提高哈茨木霉对d...
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