【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及级联放大hcr免疫诊断试剂及其应用。
技术介绍
1、现代医学领域，许多疾病的诊断和治疗都依赖一定的检测技术，无论是分子水平的核酸和蛋白质，还是细胞水平的分析都需要高灵敏度高特异度的技术来提高检测的准确性。目前，临床常用的检测手段主要包括核酸扩增、直接镜检及免疫学诊断。其中核酸扩增被认为是高灵敏高特异的检测技术之一，而免疫学诊断方法因结果的判断较为复杂、耗时长且成本较高导致难以普及或广泛使用。
2、目前主流的免疫诊断技术包括酶联免疫法(elisa)、时间分辨荧光法(trfia)、化学发光法(clia)、胶体金法四种。其中，酶联免疫吸附利用酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果，该方法检测灵敏度不高、操作方法复杂、耗时较长，受酶影响较大；时间分辨荧光根据同位素的发光特点，用时间分辨技术测量荧光来确定结果，该方法操作过于复杂；化学发光法将抗原抗体同样本结合，然后由磁珠捕捉反应物，加入发光促进剂加大反应发光强度，进而判定诊断结果，该方法制造成本太高，难以普及或广泛使用。
3、而与此相比，核酸扩增技术已经非常完善，主要分为两大类：热循环扩增和等温扩增。相对于热循环扩增，等温扩增外部条件要求更简单，不需要额外的仪器辅助变温，甚至可以在室温下反应，其中以hcr为基础的等温扩增得到人们的广泛关注。hcr反应是由pierce和dirks在2004年提出的一种体外核酸等温信号放大技术，是一个没有酶参与的过程。hcr的优点在于不需要酶的辅助，避免了非特异性扩增对分析结果的影响，反应条件温和、易控制，
4、假如能够将hcr这一信号扩增技术与各类检测技术荧光法、比色法、电化学法等联合使用，则有望在免疫诊断中能获得很高的灵敏度，并使结果的判读便的更加快速容易。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供级联放大hcr免疫诊断试剂及其应用，该检测试剂中包括hcr反应试剂，用于免疫检测的信号放大。
2、级联放大hcr反应试剂，
3、其包括：trigger探针、hcr-1试剂和hcr-2试剂；
4、所述trigger探针由片段b*和片段a*组成，其5’端标记生物素；
5、所述hcr-1试剂包括h1探针和h2探针；
6、所述h1探针，其由片段a、片段b、片段c和片段b*组成，其5’端标记荧光基团；
7、所述h2探针，其由片段d、片段b*、片段a*、片段b、片段c*和片段e组成，其3’端标记淬灭基团；
8、所述hcr-2试剂包括h3探针、h4探针、h5探针和h6探针；
9、所述h3探针，其由片段e*、片段d*、片段f和片段d组成且5’端标记荧光基团；
10、所述h4探针，其由片段d、片段g、片段d*和片段f*组成且3’端标记淬灭基团；
11、所述h5探针，其由片段g*、片段d*、片段h和片段d组成且3'端标记荧光基团；
12、所述h6探针，其由片段d、片段e、片段d*和片段h*组成且5’端标记淬灭基团；
13、其中，
14、片段a与片段a*反向互补，长度为5～10bp；
15、片段b与片段b*反向互补，长度为10～20bp；
16、片段c与片段c*反向互补，长度为5～10bp；
17、片段d与片段d*反向互补，长度为15～20bp；
18、片段e与片段e*反向互补，长度为5～10bp；
19、片段f与片段f*反向互补，长度为5～10bp；
20、片段g与片段g*反向互补，长度为5～10bp；
21、片段h与片段h*反向互补，长度为5～10bp。
22、杂交链式反应(hcr)是一种高效的核酸探针信号放大方法，利用核酸链之间的竞争作用实现杂交，并且以此作为能量来源实现信号放大，该反应具有等温无酶的特点。本专利技术将hcr系统作为免疫检测的信号放大系统。将免疫复合物通过生物素-亲和素连接桥与hcr反应体系结合，从而对其产生的信号进行放大。
23、本专利技术所述hcr反应试剂中，
24、trigger探针中从5’端至3’端，依次连接片段a*和片段b*，或者依次连接片段b*和片段a*，本专利技术对此不做限定。trigger作为hcr系统反应的启动子。在引发链trigger的5'标记生物素，引物链trigger由a*、b*两部分序列组成。
25、h1探针中，从5’端至3’端依次连接片段a、片段b、片段c和片段b*，5'端标记荧光基团。
26、h2探针中，从5’端至3’端依次连接片段d、片段b*、片段a*、片段b、片段c*和片段e，3’端标记淬灭基团。
27、hcr-1作为一级放大系统，包含探针h1、h2，在探针h1的5'标记荧光基团alexafluor 488，探针h2的3'标记淬灭基团bhq1。h1包含a、b、b*、c四部分序列，其中b与b*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，c为发卡结构的环部，a为h1的5'端单链黏性末端；h2包含a*、b、b*、c*、d、e五部分序列，其中b与b*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，a*为发卡结构的环部，c*为3'端单链黏性末端，d为5'端序列，e为3'端序列。当hcr-1放大系统中没加入引发链trigger时，h1、h2会在缓冲液中稳定共存；当加入引发链trigger后，杂交链式反应启动。引发链trigger中a*、b*两部分序列跟h1中a、b序列产生杂交反应，h1打开暴露出c、b*两部分序列，c、b*两部分序列继续跟h2中的b、c*序列产生杂交反应，打开h2暴露出a*、b*、d、e四部分序列，h2暴露出来的a*、b*两部分序列与引物链trigger中a*、b*两部分序列一致，依次会继续跟h1产生杂交反应，重复循环上述反应过程，最终生成一条双链dna链产物。
28、本专利技术实施例中，还包括二级放大系统，即hcr-2。
29、hcr-2放大系统中，包括h3探针、h4探针、h5探针和h6探针；
30、所述h3中，从5’端至3’端依次连接片段e*、片段d*、片段f和片段d，且5’端标记荧光基团；
31、所述h4中，从5’端至3’端依次连接片段d、片段g、片段d*和片段f*，且3’端标记淬灭基团；
32、所述h5中，从5’端至3’端依次连接片段g*、片段d*、片段h和片段d，且3'端标记荧光基团；
33、所述h6中，从5’端至3’端依次连接片段d、片段e、片段d*和片段h*，且5’端标记淬灭基团；
34、其中，
35、片段d与片段d*反向互补，长度为15～20bp；
36、片段e与片段e*反向互补，长度为5～10bp；
37、片段f与片段f*反向互补，长度为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.级联放大HCR反应试剂，其包括：trigger探针、HCR-1试剂和HCR-2试剂；
2.根据权利要求1所述的级联放大HCR反应试剂，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的HCR反应试剂，其特征在于，
4.根据权利要1～3任一项所述的HCR反应试剂，其特征在于，所述荧光基团为AlexaFluor 488，所述淬灭基团为BHQ1。
5.权利要求1～4任一项所述的级联放大HCR反应试剂在制备免疫检测的信号报告试剂中的应用。
6.一种免疫检测试剂，其特征在于，包括试剂R[M]、试剂R1[a]、试剂R2[b]和权利要求1～4任一项所述的HCR反应试剂；
7.根据权利要求6所述的免疫检测试剂，其特征在于，所述试剂R[M]中，磁珠与捕获抗体通过链霉亲和素-生物素连接，粒径为2～3μm。
8.根据权利要求6或7所述的免疫检测试剂，其特征在于，还包括PBST缓冲液和PBS缓冲液。
9.一种免疫检测方法，其特征在于，以权利要求6～8任一项所述的免疫检测试剂对样品进行检测。
10.根据权利
...【技术特征摘要】
1.级联放大hcr反应试剂，其包括：trigger探针、hcr-1试剂和hcr-2试剂；
2.根据权利要求1所述的级联放大hcr反应试剂，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的hcr反应试剂，其特征在于，
4.根据权利要1～3任一项所述的hcr反应试剂，其特征在于，所述荧光基团为alexafluor 488，所述淬灭基团为bhq1。
5.权利要求1～4任一项所述的级联放大hcr反应试剂在制备免疫检测的信号报告试剂中的应用。
6.一种免疫检测试剂，其特征在于，包...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙若为，张伯伦，孙一绮，
申请(专利权)人：湖南早晨纳米机器人有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。