【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制品分析领域，具体涉及一种基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法及其应用。
技术介绍
1、生物制品的原液生产工艺一般分为以细胞培养为主的上游工艺和以多步纯化工序为主的下游工艺。其中，上游工艺研究主要关注操作条件对细胞生长特性、代谢水平和目的产物的影响，但在上游工艺研究中还无法及时得知目的蛋白的准确含量。随后经裂解细胞、收获裂解液，再经澄清、离心后进入下游纯化工艺。下游工艺主要依靠多种层析方法配合使用，实现产品相关杂质或工艺相关杂质的去除与控制。
2、为将少量的目的蛋白从众多蛋白中分离出来，研究人员往往会给目的蛋白带上纯化标签，便于通过层析工艺实现目的蛋白的收获与富集。组氨酸标签是最简单，使用最广泛的标签，它通常由6-10个连续的组氨酸构成，它可以与固定化的过渡金属离子形成配位键，利用这一特性可纯化携带组氨酸标签的蛋白，在层析过程中，蛋白因与金属离子的亲和力不同而分离。包括亲和层析在内的层析方法均需将蛋白上样载量控制在合理范围，低载或高载都可能导致样品的损失或杂质的增加，因此载量控制对于层析步骤的工艺至关重要。生产中常用的上样方法有体积上样和质量上样，体积上样是指控制上样体积，但在放大生产中，目的蛋白浓度可能与小试中存在较大差别，因此体积上样极易造成低载或高载。质量上样可以避免此问题，但需在上样前得知目的蛋白的准确浓度。对于细胞裂解液等复杂样品，由于存在众多杂蛋白的干扰，准确测定含组氨酸标签的目的蛋白的浓度是困难的。
3、综上所述，寻求一种简单、可靠、易操作的分析方法用于准
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法及其应用。所述分析方法可以对组氨酸标签蛋白准确定量，用于快速指导工艺研发和生产过程。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，所述分析方法包括：
4、(1)制备参比品溶液、质控品溶液和待测样品溶液，进行imac-hplc检测；
5、(2)以参比品溶液的上样量为横坐标x，组氨酸标签蛋白峰面积为纵坐标y，拟合线性方程得到标准曲线；
6、(3)将质控品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线，计算得到质控品组氨酸标签蛋白的实测上样量，实测上样量与理论上样量的比值为回收率；将待测样品溶液中组氨酸标签蛋白峰面积带入标准曲线，计算得到待测样品中组氨酸标签蛋白的实测上样量，实测上样量与样品进样体积的比值为组氨酸标签蛋白浓度。
7、本专利技术首次将固定化金属离子亲和层析(imac)与hplc技术相结合应用于指导商业蛋白工艺研发及生产，可准确快速指导商业蛋白工艺研发及生产过程包括但不限于细胞裂解液亲和层析上样，减少目的蛋白过载或低载情况发生，极大的节省研发和生产费用。
8、优选地，步骤(1)中，所述参比品溶液和质控品溶液由如下步骤制备得到：
9、将消光系数大于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于水中，配制成1.0±0.2mg/ml参比品溶液或质控品溶液，例如可以是0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml或1.2mg/ml等；
10、将消光系数小于0.6的组氨酸标签蛋白参比品溶于水中，配制成7.0±0.2mg/ml参比品溶液或质控品溶液，例如可以是6.8mg/ml、6.9mg/ml、7.0mg/ml、7.1mg/ml或7.2mg/ml等。
11、优选地，所述溶剂选自水或稀释缓冲液，所述稀释缓冲液为15-25mm hepes+450-550mm nacl，ph为7.3-7.7。
12、其中，“15-25mm hepes”例如可以是15mm、17mm、19mm、20mm、21mm、23mm或25mm等。
13、“450-550mm nacl”例如可以是450mm、470mm、490mm、500mm、510mm、530mm或550mm等。
14、“ph为7.3-7.7”例如可以是7.3、7.4、7.5、7.6或7.7等。
15、本专利技术中，使用的检测器为紫外检测器，当组氨酸标签蛋白消光系数k≥0.6时，组氨酸标签蛋白在5-50μg范围内线性良好；当组氨酸标签蛋白消光系数k＜0.6时，组氨酸标签蛋白在35-350μg范围内线性良好。
16、本专利技术中，若样品浓度低于定量下限，依据目的蛋白性质选择合适规格的超滤离心管和离心条件对样品进行浓缩预处理。若样品浓度高于定量上限，用稀释缓冲液或超纯水将样品稀释至定量范围。
17、优选地，步骤(1)中，在所述imac-hplc检测中，通过改变参比品溶液的进样体积，控制参比品溶液的上样量。
18、优选地，步骤(1)中，所述imac-hplc检测的色谱柱的填料为螯合了ni2+的色谱柱填料，优选为polar mc30-ni excel色谱柱。
19、色谱柱的填料结构如下所示：
20、
21、本专利技术中，采用固定化金属离子亲和色谱对携带组氨酸标签的目的蛋白进行定量检测。固定化金属离子亲和色谱是将过渡金属离子通过配体螯合在固相基质上，过渡金属离子带正电，可与局部带有负电荷的组氨酸标签相吸引，从而与携带组氨酸标签的目的蛋白特异性结合形成相对稳定的复合物，之后利用咪唑以竞争性洗脱方式实现目的蛋白的富集、分离和分析，洗脱先后顺序与目的蛋白结合能力相关。常用于含有组氨酸标签蛋白的分离纯化与分析的过渡金属离子有zn2+、ni2+、cu2+、co2+等。本专利技术所使用的关键耗材色谱柱填料为螯合ni2+型polar mc-imac excel，它是一种金属亲和层析填料，以聚甲基丙烯酸酯微球为基质，粒径为30μm，孔径为具有较高的物理和化学稳定性，此外，polar mc-imacexcel具有高度亲水性，可最大程度地避免与生物类样品的非特异性吸附，非常适用于富集、分离、分析含组氨酸标签的蛋白。
22、优选地，步骤(1)中，所述imac-hplc检测采用梯度洗脱方法对样品进行分离。
23、优选地，步骤(1)中，所述imac-hplc检测的流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为15-25mm hepes+450-550mm nacl；所述流动相b为15-25mm hepes+450-550mmnacl+450-550mm咪唑。
24、其中，“15-25mm hepes”例如可以是15mm、17mm、19mm、20mm、21mm、23mm或25mm等。
25、“450-550mm nacl”例如可以是450mm、470mm、490mm、500mm、510mm、530mm或550mm等。
26、“4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述参比品溶液和质控品溶液由如下步骤制备得到：
3.根据权利要求1或2所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，在所述IMAC-HPLC检测中，通过改变参比品溶液的进样体积，控制参比品溶液的上样量。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述IMAC-HPLC检测的色谱柱的填料为螯合了Ni2+的色谱柱填料，优选为Polar MC30-Ni Excel色谱柱。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述IMAC-HPLC检测采用梯度洗脱方法对样品进行分离。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述IMAC-HPLC检测的流速为0.8±0.2mL/min。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述IMAC-HPLC检测的梯度洗脱的程序为：
9.根据权利要求1-8中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述IMAC-HPLC检测的柱温设置为25±5℃。
10.权利要求1-9中任一项所述的基于IMAC-HPLC测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法在蛋白工艺研发和/或生产过程中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述参比品溶液和质控品溶液由如下步骤制备得到：
3.根据权利要求1或2所述的基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，在所述imac-hplc检测中，通过改变参比品溶液的进样体积，控制参比品溶液的上样量。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述imac-hplc检测的色谱柱的填料为螯合了ni2+的色谱柱填料，优选为polar mc30-ni excel色谱柱。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于imac-hplc测定组氨酸标签蛋白浓度的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述imac-hplc检测采用梯度洗脱方法对样品进行分离。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于imac-hpl...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟晓洁，曹翔剑，杨瑾，
申请(专利权)人：杭州明德生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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