【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域，具体公开一种趋化因子ccl3的制备方法及其在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
技术介绍
1、肿瘤的免疫治疗是一种新兴的癌症治疗方法，它利用患者自身的免疫系统来识别和攻击肿瘤细胞。这种治疗方法已经取得了一些令人鼓舞的成果，但也存在一些限制和挑战。肿瘤的免疫治疗是近年来发展较为迅速的治疗策略，免疫治疗的主要方法包括：(1)免疫检查点抑制剂：这些药物可以阻止免疫系统中的抑制性信号，从而增强免疫细胞对癌细胞的攻击能力；例如，抗pd-1和抗ctla-4抗体可以增强t细胞的活性。(2)car-t细胞疗法(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，全称嵌合抗原受体t细胞免疫疗法)：这是一种个性化的治疗方法，通过工程改造患者的t细胞，使其能够更有效地识别和摧毁癌细胞。(3)癌疫苗：癌疫苗可以刺激免疫系统产生针对癌细胞的免疫应答，帮助控制肿瘤生长。
2、肿瘤屏障是指一系列因素和机制，阻碍了机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和攻击。这些屏障是肿瘤形成和发展的一部分，它们允许肿瘤细胞逃脱免疫系统的监测和清除。肿瘤微环境中存在的屏障主要有三类：一是物理屏障，由细胞外基质组成的物理屏障是阻止免疫细胞进入肿瘤微环境的主要原因，细胞外基质(extracellular matrix，ecm)是组织中位于细胞外的三维结构，它具有多种生物学功能，包括提供支持、调节信号传导、细胞迁移和细胞黏附等；二是代谢微环境屏障：主要是肿瘤细胞的糖代谢影响肿瘤代谢微环境，从而塑造有利于肿瘤细胞
3、三级淋巴结构tls(tertiary lymphoid structures)是淋巴结的次生淋巴组织，通常形成在非淋巴组织的炎症或感染部位，以协助免疫反应。tls类似于淋巴结，但它们不是先天存在的，而是在免疫系统对抗某些刺激时形成的。三级淋巴结构的形成代表着较好的免疫浸润，大量文献报道，三级淋巴结构的数量和成熟度与较好的预后高度相关。但是如何形成和诱导成熟三级淋巴结构，增强肿瘤免疫浸润是目前肿瘤免疫治疗的热点问题。
4、目前，采用免疫检查点治疗需通过静脉给药，一方面会造成全身的免疫系统的功能紊乱，另一方面会造成治疗耐药。且由于存在肿瘤屏障，导致免疫检查点抑制剂难以进入肿瘤区域内部发挥疗效，患者本身的具备抗肿瘤的免疫细胞也难以进入肿瘤内部，从而导致肿瘤的免疫治疗效果不佳。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种可缓释的趋化因子ccl3的制备方法，以及趋化因子ccl3在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，联合局部定点穿刺技术突破肿瘤屏障，溶解肿瘤外的物理屏障，并长期释放趋化因子，重塑肿瘤免疫微环境，诱导形成三级淋巴结构，增强肿瘤免疫治疗的效果，从而解决肿瘤免疫浸润差，免疫治疗效果不佳的问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
3、一种趋化因子ccl3在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
4、趋化因子ccl3全称是趋化因子(c-c)基序配体3(c-c motif chemokine ligand3)，是一种cc家族的趋化因子配体，具有募集免疫细胞的功能，根据其相应配体的不同，可以选择性募集效应型免疫细胞，如t细胞、nk细胞、巨噬细胞等，并诱导形成三级淋巴结构，进而增强免疫系统抗肿瘤作用。目前，ccl3选择性募集免疫细胞，形成三级淋巴结构将免疫“冷肿瘤”激活成免疫“热肿瘤”尚未见报道。本专利技术提供趋化因子ccl3在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，该药物通过定点穿刺靶向递送缓释细胞因子，达到突破免疫屏障增强免疫治疗的技术效果。
5、上述的应用，优选的，所述趋化因子ccl3的制备方法如下：
6、(1)根据趋化因子ccl3的编码基因cds序列区段，设计并构建含趋化因子ccl3编码基因的重组腺相关病毒raav6或raav8质粒；
7、(2)将所述含趋化因子ccl3编码基因的重组腺相关病毒表达质粒与包装质粒、辅助质粒一起，采用磷酸钙转染法三质粒共转染293t细胞进行重组病毒包装，经分离、纯化、鉴定后，得到过表达趋化因子ccl3的腺相关病毒raav6-ccl3或raav8-ccl3；
8、(3)培养所述过表达趋化因子ccl3的腺相关病毒raav6-ccl3或raav8-ccl3，得到其病毒液，即得到所述的趋化因子ccl3。
9、优选的，趋化因子ccl3的编码基因为人类趋化因子ccl3编码基因或小鼠趋化因子ccl3编码基因，所述人类趋化因子ccl3编码基因的ds序列如seq id no.1所示，所述小鼠趋化因子ccl3编码基因的ds序列如seq id no.2所示；人类趋化因子ccl3编码基因pcr扩增引物对的上下游序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示；小鼠趋化因子ccl3编码基因pcr扩增引物对的上下游序列分别如seq id no.5、seq id no.6所示。
10、优选的，所述肿瘤免疫治疗药物为用于局部定点穿刺的药物。
11、优选的，所述肿瘤免疫治疗药物针对的肿瘤细胞为hepa1-6、hepa-g2、huh7或hepa3b。
12、优选的，所述肿瘤免疫治疗药物为免疫治疗原位肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌或甲状腺癌的药物。
13、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种趋化因子ccl3的制备方法的制备方法，所述趋化因子ccl3的制备方法包括如下步骤：
14、(1)根据趋化因子ccl3的编码基因cds序列区段，设计并构建含趋化因子ccl3编码基因的重组腺相关病毒raav6或raav8质粒；
15、(2)将所述含趋化因子ccl3编码基因的重组腺相关病毒表达质粒与包装质粒、辅助质粒一起，采用磷酸钙转染法三质粒共转染293t细胞进行重组病毒包装，经分离、纯化、鉴定后，得到过表达趋化因子ccl3的腺相关病毒raav6-ccl3或raav8-ccl3；
16、(3)培养所述过表达趋化因子ccl3的腺相关病毒raav6-ccl3或raav8-ccl3，得到其病毒液，即得到所述的趋化因子ccl3。
17、上述的制备方法，优选的，趋化因子ccl3的编码基因为人类趋化因子ccl3编码基因或小鼠趋化因子ccl3编码基因，所述人类趋化因子ccl3编码基因的ds序列如seq idno.1所示，所述小鼠趋化因子ccl3编码基因的ds序列如seq id no.2所示；人类趋化因子ccl3编码基因pcr扩增引物对的上下游序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示；小鼠趋化因子ccl3编码基因pcr扩增引物对的上下游序列分别如seq id no.5、seq id n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种趋化因子CCL3在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述趋化因子CCL3的制备方法如下：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，趋化因子CCL3的编码基因为人类趋化因子CCL3编码基因或小鼠趋化因子CCL3编码基因，所述人类趋化因子CCL3编码基因的DS序列如SEQ ID No.1所示，所述小鼠趋化因子CCL3编码基因的DS序列如SEQ ID No.2所示；人类趋化因子CCL3编码基因PCR扩增引物对的上下游序列分别如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4所示；小鼠趋化因子CCL3编码基因PCR扩增引物对的上下游序列分别如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物为用于局部定点穿刺的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物针对的肿瘤细胞为Hepa1-6、Hepa-G2、Huh7或Hepa3B。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物为免疫治
7.一种趋化因子CCL3的制备方法的制备方法，其特征在于，所述趋化因子CCL3的制备方法包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，趋化因子CCL3的编码基因为人类趋化因子CCL3编码基因或小鼠趋化因子CCL3编码基因，所述人类趋化因子CCL3编码基因的DS序列如SEQ ID No.1所示，所述小鼠趋化因子CCL3编码基因的DS序列如SEQ ID No.2所示；人类趋化因子CCL3编码基因PCR扩增引物对的上下游序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示；小鼠趋化因子CCL3编码基因PCR扩增引物对的上下游序列分别如SEQ IDNo.5、SEQ IDNo.6所示。
9.一种含有趋化因子CCL3编码基因的重组腺相关病毒表达质粒。
10.一种过表达趋化因子CCL3的腺相关病毒rAAV6-CCL3或rAAV8-CCL3。
...【技术特征摘要】
1.一种趋化因子ccl3在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述趋化因子ccl3的制备方法如下：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，趋化因子ccl3的编码基因为人类趋化因子ccl3编码基因或小鼠趋化因子ccl3编码基因，所述人类趋化因子ccl3编码基因的ds序列如seq id no.1所示，所述小鼠趋化因子ccl3编码基因的ds序列如seq id no.2所示；人类趋化因子ccl3编码基因pcr扩增引物对的上下游序列分别如seq id no.3、seq idno.4所示；小鼠趋化因子ccl3编码基因pcr扩增引物对的上下游序列分别如seq id no.5、seq idno.6所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物为用于局部定点穿刺的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗药物针对的肿瘤细胞为hepa1-6、hepa-g2、huh7或hepa3b。<...
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