一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法技术

技术编号：40238260 阅读：4 留言：0更新日期：2024-02-02 22:37

本发明专利技术涉及一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法，属于同源四倍体鉴定技术领域，包括如下步骤：待白菜型油菜加倍处理植株开花，形态学观察后挑选出四倍体疑似株；目镜测微尺测量加DAPI染色法确定单核时期新鲜花蕾长度范围，结合改良苯酚品红染色法判断单核时期花粉粒形态；在随后同品类植株的鉴定工作中，直接挑选单核时期新鲜花蕾，释放出花粉粒后滴加改良苯酚品红染液显微观察花粉粒形态，若视野范围内花粉粒形态为四瓣及以上，则判定该植株为白菜型油菜同源四倍体，若视野范围内花粉粒形态为三瓣，则判定该植株为白菜型油菜二倍体。本发明专利技术提供的同源四倍体快速鉴定方法，能在短时间内高效准确地鉴定批量材料。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多倍体育种领域，具体涉及一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法。

技术介绍

1、白菜型油菜(brassicacampestrisl.)是油菜三大类型之一，又称小白菜,矮油菜,甜油菜等。属于十字花科芸薹属作物，在我国蔬菜生产中占有重要地位。多倍体与二倍体比拥有较大的营养器官和生殖器官,营养物质更为丰富，并且在生长过程中表现出更强的抗性。根据与二倍体植株在形态学、细胞学以及dna含量上的差异，目前，多倍体鉴定主要涉及三种途径。形态学：与二倍体相比，多倍体植株具有叶片增厚、花器官变大及花粉粒形态异常等特点，常用来初期筛选变异株。但是在生产实际中，植株也常因生长条件变化而表现出形态上的差异，因此利用形态学判断植株倍性准确率较低。细胞学：利用染色体制片技术，对根尖体细胞、雄蕊减数分裂细胞及雌蕊体细胞进行染色体计数，能够准确、直接地判断植株倍性，但是制片过程较为复杂，难以在短时间内实现大批量鉴定。dna含量鉴定：采用流式细胞术，对叶片细胞核dna含量进行分析，通过与二倍体dna含量相比判断植株倍性，但对所需仪器设备要求高，价格昂贵，以及需结合染色体计数才能精准确定植株倍性。

2、拟南芥和芸薹属植物萌发沟数量与花粉倍性相关。开花植物的花粉粒被外壁包围，外壁不均匀沉积在花粉粒表面，导致某些区域几乎没有外壁物质，这些区域发育成萌发沟，帮助花粉水合、改变体积和萌发。在拟南芥中，二倍体和三倍体植株的花粉粒一般为三沟萌发沟，四倍体植株的花粉粒大多为四沟或者六沟萌发沟。

技术实现思路

<p>1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法，具有高效、节约成本、准确率高的特点，能在短时间内实现对白菜型油菜同源四倍体的批量检测。

2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：

3、一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法，包括以下步骤：

4、s1、待加倍处理植株开花，形态学观察后选出四倍体疑似株；

5、s2、取四倍体疑似株的新鲜未开放花蕾置于干净的载玻片上，于带目镜测微尺的体式显微镜下观察并记录花蕾长度，去除萼片及花瓣，并取出六个花药置于清水中；

6、s3、取一个所述的花药置于另一个干净载玻片上，滴加少量清水，切断花药，用解剖针轻轻挤压花药腔释放出花粉粒，挑出杂质，滴加20μl 0.5％dapi染液并混匀，避光染色10min后盖上盖玻片，制成临时装片1；

7、s4、在正置荧光显微镜下观察临时装片1并记录小孢子发育时期，若小孢子处于单核时期，则进行下一步；若小孢子处于其他时期，则重复步骤s1-s4；

8、s5、取余下五个步骤s2所述的花药，整齐排列在干净的载玻片上，滴加清水，切断花药，用解剖针挤压花药腔释放出花粉粒，去除碎片，滴加20μl0.5％改良苯酚品红溶液并混匀，轻轻盖上盖玻片，用滤纸吸去多余染液，制成临时装片2；

9、s6、在普通光学显微镜下对临时装片2中的花粉粒形态进行观察，若视野范围内花粉粒形态为四瓣及以上，则判定为四倍体；若视野范围内花粉粒形态为三瓣，则判定为二倍体；

10、s7、在鉴定余下四倍体疑似株时，挑选在s2所记录的新鲜花蕾在单核时期的长度范围内的新鲜花蕾，直接进行步骤s5-s6。

11、进一步地，所述的步骤s2中，取出的六个花药要注意保湿，避免萎蔫。

12、进一步地，所述的步骤s4中，所选花蕾应处于单核小孢子时期，若花蕾处于减数分裂时期，四个小孢子还未释放；若花蕾处于二核及三核时期，花粉粒逐渐变大变圆，不便于判断其形态。

13、进一步地，所述的步骤s5中，需完全释放花粉粒，盖上盖玻片后避免按压，以免压碎花粉粒，破坏其形态。

14、进一步地，所述的步骤s6中，临时装片2与临时装片1应来源于同一花蕾，且每个装片至少观察三个视野。

15、进一步地，所述的步骤s7中，根据每个物种不同品种间的差异，其单核期花粉的花蕾长度不同。因此，对白菜型油菜中不同品种中的二倍体及四倍体疑似株，每个品种的单核期花蕾长度范围测定应至少选择3株二倍体或四倍体疑似株，每株至少重复5个花蕾，以确保具有生物学统计意义。

16、进一步地，所述的步骤s7中，直接鉴定同源四倍体疑似株时，每个植株至少挑选三个花序，同一花序至少挑选三个花蕾。

17、本专利技术具有以下有益效果：

18、1、本专利技术首先利用目镜测微尺测量加dapi染色法判断白菜型油菜新鲜单核小孢子时期花蕾的长度范围，之后根据此长度范围直接选取新鲜花蕾，改良苯酚品红染色法对花粉粒进行染色随之判断花粉粒形态。利用本专利技术技术方案，解决了现有技术中白菜型油菜同源四倍体鉴定过程复杂、周期长等问题。

19、2、相较于形态学鉴定、染色体计数鉴定及流式细胞术，本专利技术技术方案操作简单易行，成本低，仪器设备要求低，但准确率高，能够实现白菜型油菜同源四倍体的快速批量鉴定。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤S2中，取出的六个花药要注意保湿，避免萎蔫。

3.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤S4中，所选花蕾应处于单核小孢子时期，若花蕾处于减数分裂时期，四个小孢子还未释放；若花蕾处于二核及三核时期，花粉粒逐渐变大变圆，不便于判断其形态。

4.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤S5中，需完全释放花粉粒，盖上盖玻片后避免按压，以免压碎花粉粒，破坏其形态。

5.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤S6中，临时装片2与临时装片1应来源于同一花蕾，且每个装片至少观察三个视野。

6.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤S7中，每个品种的单核期花蕾长度范围测定应至少选择3株二倍体或四倍体疑似株，每株至少重复5个花蕾。

7.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤S7中，直接鉴定同源四倍体疑似株时，每个植株至少挑选三个花序，同一花序至少挑选三个花蕾。

...

【技术特征摘要】

1.一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤s2中，取出的六个花药要注意保湿，避免萎蔫。

3.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤s4中，所选花蕾应处于单核小孢子时期，若花蕾处于减数分裂时期，四个小孢子还未释放；若花蕾处于二核及三核时期，花粉粒逐渐变大变圆，不便于判断其形态。

4.根据权利要求1所述的一种白菜型油菜同源四倍体的快速鉴定方法,其特征在于：所述的步骤s5中，需完全释放花粉粒，盖上盖玻片后避...

【专利技术属性】
技术研发人员：位芳，谢正清，王博扬，师恭曜，张露月，田保明，郭佳林，陈薇薇，曹刚强，田昭然，王奥，李晓颖，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人