【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体属于微生物细胞表面展示领域，更具体涉及一种微生物细胞表面展示目的蛋白的效率评估方法。
技术介绍
1、微生物细胞表面展示技术是近年来对微生物细胞表面改性的生物改性方法。利用基因工程手段将有特定功能的外源蛋白基因与锚定蛋白基因相融合，并在微生物宿主细胞中表达，从而使目的蛋白展示在微生物细胞表面，被展示的多肽和蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。微生物表面展示系统已被广泛研究，包括：大肠杆菌的嵌合体外膜蛋白a（lpp-ompa）、外膜蛋白c（ompc）和冰晶核蛋白（inaz）等；酿酒酵母的α-凝集素、a-凝集素和絮凝素系统；枯草芽孢杆菌的芽孢包裹蛋白cotz和cgea系统等。应用表面展示技术的关键问题在于：1）目的蛋白成功展示在微生物细胞表面；2）目的蛋白表面展示的分子数量尽可能高；3）表面展示后目的蛋白的功能正常。然而，锚定蛋白（anchor protein）、乘客蛋白（passenger protein）和宿主细胞的特性以及融合方法都会影响蛋白质表面展示的效率。因此，开发表面展示效率的高效评估方法对推广和优化表面展示技术应用的意义重大。
2、在表面展示技术发展初期，最常用的评估方法为抗原-抗体免疫荧光法，其将6×his，flag、ha、myc等小标签肽和目的蛋白融合表达，外源加入标签肽相应的一抗和荧光标记的二抗进行孵育，利用荧光显微镜和流式细胞技术对细胞表面展示效率进行评估。但该方法存在固有的缺点：1）成本高，由于它依赖两次抗体孵育，抗体制备成本高（单克隆抗体制备技术的最新进展[j
3、绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, gfp）是应用最为广泛的荧光蛋白，gfp由11条β折叠循环排列形成桶状结构，而含有发色团的α-螺旋被包含在桶的内部。gfp蛋白k214和r215残基之间可以断裂，产生一个含214个残基的n端肽段（gfp1-10）和一个15个氨基酸残基组成的c端肽段（gfp11）( in vivo and in vitro protein solubilityassays using split gfp. nat methods 2006, 3 (10), 845-54)，gfp11小肽是目前已知的最小的split片段，最小化影响与之融合的蛋白。这两个片段单独存在时没有荧光信号，但在溶液中同时存在时，两个片段自发组装形成完整的gfp，且重组蛋白的荧光性质与天然蛋白几乎没有区别。split gfp每个片段被定向进化改造后提高了其溶解度和互补效率，被广泛应用于蛋白质拓扑、亚细胞定位、蛋白质聚集以及可溶蛋白表达定量评估。gfp11融合蛋白的数量与互补后发出的荧光强度之间存在完美的相关性，检测灵敏度为亚皮摩尔（invivo and in vitro protein solubility assays using split gfp [j]. nat methods,2006, 3 (10): 845-854），使其发展为评估可溶蛋白表达量的方法。gfp1-10/gfp11被用做酵母表面展示抗体荧光标记，通过流式细胞仪简单定性地评估其标记表面展示抗体的能力，gfp1-10/gfp11系统与传统荧光标记的效果一致，均能成功评估抗体的膜定位情况（fluorescent labeling of antibody fragments using splitgfp [j]. plos one,2010,6(10): e25727）。尽管gfp1-10/gfp11被广泛应用，但利用gfp1-10/gfp11系统全面评估微生物细胞表面展示的膜定位以及表面展示效率的研究鲜有报道。
技术实现思路
1、基于上述现有技术中关于两个split-gfp的发光原理，本专利技术建立了两套准确评价微生物表面展示目的蛋白能力的方法，其不仅能够快速方便地定性评估目的蛋白的展示，还能够定量分析目的蛋白在单个微生物细胞表面的展示数量。基于split-gfp的表面展示效率评价方法与传统的免疫荧光法相比有以下优点：1）成本低，体外纯化gfp1-10或gfp1-9后保存蛋白用于多次孵育实验，不需要消耗昂贵的抗原-抗体试剂。2）实验操作简单，该方法只需利用gfp1-10或gfp1-9与表面展示微生物孵育一次即可观察，且split gfp单独片段没有荧光，不需要对细胞进行洗涤；3）孵育条件要求低本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于Split GFP定量评估微生物表面展示效率的方法，其特征在于，将锚定蛋白、目标蛋白和split GFP小肽片段融合表达的表面展示微生物，与split GFP小肽互补片段孵育，通过检测Split GFP片段自组装后的荧光强度定量评估微生物表面展示目标蛋白的效率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Split-GFP小肽互补片段选自但不限于GFP1-10和GFP1-9，对应的小肽片段选自但不限于GFP11和GFP10-11。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Split-GFP小肽互补片段在体外与所述表面展示微生物的孵育时间为1-1440 min，孵育浓度为0.05 μM - 1 mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面展示微生物的种类选自但不限于大肠杆菌、酵母菌、贪铜菌属、芽孢杆菌、丝状真菌；相应的，采用适用于所述表面展示微生物的种类的蛋白表面展系统。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表面展示微生物的表面展示效率包括但不限于锚定蛋白的展示效率、单个细胞锚定蛋白的展示个
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Split-GFP的检测手段包括但不限于酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的gfp1-10是如SEQ ID No.1所示核苷酸编码的氨基酸序列，或与其同一性80%以上，85%以上，90%以上，95%以上，98%以上，99%以上的氨基酸序列并仍保持其功能；所述gfp11是如SEQ ID No.2所示核苷酸编码的氨基酸序列，或与其同一性80%以上，85%以上，90%以上，95%以上，98%以上，99%以上的氨基酸序列并仍保持其功能。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的gfp1-9是如SEQ ID No.3所示核苷酸编码的氨基酸序列，或与其同一性80%以上，85%以上，90%以上，95%以上，98%以上，99%以上的氨基酸序列并仍保持其功能；所述gfp10-11是如SEQ ID No.4所示核苷酸编码的氨基酸序列，或与其同一性80%以上，85%以上，90%以上，95%以上，98%以上，99%以上的氨基酸序列并仍保持其功能。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法的应用，其特征在于，用于不同表面展示系统中锚定蛋白和目的蛋白展示效率的评价，作为不同微生物新型锚定蛋白寻找和开发的评价工具。
...【技术特征摘要】
1.一种基于split gfp定量评估微生物表面展示效率的方法，其特征在于，将锚定蛋白、目标蛋白和split gfp小肽片段融合表达的表面展示微生物，与split gfp小肽互补片段孵育，通过检测split gfp片段自组装后的荧光强度定量评估微生物表面展示目标蛋白的效率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的split-gfp小肽互补片段选自但不限于gfp1-10和gfp1-9，对应的小肽片段选自但不限于gfp11和gfp10-11。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的split-gfp小肽互补片段在体外与所述表面展示微生物的孵育时间为1-1440 min，孵育浓度为0.05 μm - 1 mm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面展示微生物的种类选自但不限于大肠杆菌、酵母菌、贪铜菌属、芽孢杆菌、丝状真菌；相应的，采用适用于所述表面展示微生物的种类的蛋白表面展系统。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表面展示微生物的表面展示效率包括但不限于锚定蛋白的展示效率、单个细胞锚定蛋白的展示个数、目的蛋白的展示效率、单个细胞目的蛋白的展示个数。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张燕飞，张丽，谭玲，刘美子，陈云虹，赵国屏，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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