【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，涉及单核苷酸多态性的等温检测与分型，具体涉及基于rnase hⅱ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增荧光技术(lamp-lna-blocker-rnase hⅱ-eve green,lamp-lbr-eve)的单核苷酸多态性基因分型检测体系的方法。
技术介绍
1、耳聋是由遗传或环境因素引起，其中遗传因素占50％。按其遗传方式可分为常染色体显性遗传、常染色体隐形遗传、x连锁遗传和线粒体遗传等。在遗传致聋因素中，线粒体dna(mitochondrion dna,mt dna)突变与药物性耳聋及非综合征型耳聋的发病密切相关。国内外大量、系统的研究表明：线粒体dna 1555a>g和1494c>t突变为母系遗传药物性耳聋发生的遗传基础，氨基糖甙类抗生素是其致聋的主要诱因。
2、线粒体是存在于大多数真核细胞中的一类具有双层膜结构的半自主细胞器，拥有独立的遗传物质即mt dna。mt dna突变在全世界不同地区存在差异，1555a>g突变，在普通人群的发生率为0.08％～0.7％，耳聋人群中的发生率为0.42％～17％，而1494c>t突变则分别为0.01％～0.25％和0.18％～0.7％。1555a>g和1494c>t的突变，改变了线粒体12srrna高度保守区域结构，使得其转录后的rrna结构与细菌16s rrna结构相似，从而易于与氨基糖甙类抗生素结合。氨基糖甙类抗生素，如链霉素、庆大霉素等，能够与突变后的线粒体12s rrna相结合，使得线粒体核糖体空间
3、目前耳聋基因遗传学检测技术包括下一代测序技术、多重连接探针扩增技术、变性高效液相色谱、微阵列基因芯片检测技术、实时荧光检测技术、片段分析技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、高分辨率熔解曲线分析技术、sanger测序等。但相关技术存在检测环境要求高、实验操作复杂、设备相对昂贵、时间长等缺点，难以在基层医院和社区诊所普及。
4、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)在恒温条件下，能快速、高效、特异地扩增dna。该技术的原理是针对靶基因的6～8个特定区域设计6～8种引物，利用一种链置活性的dna聚合酶在恒温条件下催化新链的合成，在短时间内可以实现核酸扩增。lamp可以在15～60min内扩增出109靶序列拷贝。lamp引物的设计是该技术的核心。lamp引物设计主要靶定在靶序列上的6个序列区间，分别标记为f3c、f2c、f1c、b1、b2和b3，根据这6个区间共设计4条引物fip、bip、f3、b3。正向内引物fip由f1c序列和f2序列组成，反向内引物bip由b1c序列和b2序列组成，f3为正向外引物(与f3c序列互补)，b3为反向外引物(与b3c序列互补)。fip、bip、f3、b3引物为必需引物，为了提高lamp反应速度，常在反应体系中添加两条环引物，即lf引物与lb引物。内引物与靶基因的响应区域杂交结合后，在bst聚合酶的作用下开始链的合成，由此触发lamp反应。接下来，外引物f3/b3分别与f3c和b3c结合，各自合成出一条单链进而置换出内引物合成的两条单链。由于这两条链的5'端各自有互补的区域，因此各自会形成一个环状结构。随后在另一条外引物的作用下，另一端也形成一个环状结构，由此形成了lamp反应的初始哑铃结构。以自身结构为模板，3'端的f1区域作为起点，内引物的f1c区域与哑铃结构的f1区域结合，f2区域和f2c区域结合，由此触发循环链置换放大扩增反应；同样bip与哑铃结构的另一端茎环结构的b2c区域互补，启动下一轮放大扩增。由此周而复始，至lamp反应结束，扩增体系里产生了大量由相同特异性序列的反向重复片段组成的dna片段混合物。但lamp容易形成气溶胶，加上bst聚合酶缺乏保真性，特异性低，且反应体系中存在多对引物，容易产生假阳性。
5、锁核酸(locked nucleic acid,lna)是一种含有桥接双环糖基的合成核酸类似物。在2'-o-和4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖“锁定”为3'-内构象。lna:dna杂交体与其对应的dna:dna相比，其退火温度会大幅度升高。dna引物中每掺入一个lna核苷酸可使tm值增加3～8℃。掺入lna核苷酸后，由于lna在错配位点形成watson-crick碱基对的倾向更强，导致探针通过单核苷酸多态性区分等位基因的能力大大增强。
6、blocker探针为人工合成的一段单链核苷酸序列，blocker探针与引物最大的区别在于其3′-oh端以3′-spacer c3或3′-phosphat进行修饰。由于其3′-oh被封闭，因此，其不能参与pcr的延伸反应。在pcr退火阶段，野生型blocker序列与野生型模板完全互补配对，阻碍突变型pcr引物与野生型模板结合；而突变型blocker序列与突变型模板配对，阻碍野生型引物与突变型模板结合。由于lna的作用，lna-blocker将优先与模板结合，从而增加检测体系的特异性。
7、rnase hⅱ是一种来源于极端耐热菌株的内源性核酸内切酶，它识别rna/dna杂交链并切割rna链，其对单链rna切割活性极低，且对dsdna、ssdna无切割活性。因此只有当互补靶dna碱基存在时，rnase hⅱ才能消化dna-rna杂交链，使dna-rna杂交链在rna碱基的5′侧发生裂解，留下具有3′-oh的dna寡核苷酸，该3′-oh dna寡核苷酸能够起到引物的作用，从而允许引物延伸。由于仅在与互补靶序列紧密结合时才发生rna化引物的裂解切割，故极大地提高了反应的准确性。rnase hⅱ的应用需要配合专一的特殊引物。该引物含有一个rna残基和一个3′端封闭部分。在引物与目标dna杂交后，rna碱基的5′端，被rnase hⅱ酶识别并切割，得到的3′-oh，从而获得延伸的能力。
技术实现思路
1、本申请提供了一种恒温条件下的单基因多态性基因分型技术。该技术利用rnasehⅱ酶特异性水解dna-rna杂合链中的rna，但不水解单链或双链dna或rna中的磷酸二酯键，即不消化单链或双链dna或rna的特点，分别设计针对野生型和突变型的rna/dna杂合型引物，辅以对应的锁核酸-阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基识别和扩增能力，确保体系的保真性。只有在无阻滞探针结合的情况下、rna/dna杂合引物在与目标dna碱基序列互补时，引物的rna一侧才能被rnase hⅱ降解，从而获得延伸能力，在链置环活性bst-taq聚合酶作用下催化新链合成，同时而环引物的延伸能够显著提高lamp的扩增效率，短时间内实现核酸大量扩增，通过检测荧光信号对实时扩增进行监测。据此建立基于rnasehⅱ酶依赖-锁本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测药物性耳聋基因的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测1555A位点的第一引物组和检测1555G位点的第二引物组，其中外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、FIP引物为共同的；
2.一种检测药物性耳聋基因的体系，其特征在于，所述体系包括如权利要求1所述的引物组合物。
3.根据权利要求2所述的体系，其特征包括LAMP引物、LNA修饰的Blocker探针、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、RNase HII、石蜡油、甜菜碱和ddH2O。
4.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述DNA模板的用量为1～5μL。
5.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述酶溶液为Bst DNA聚合酶和RNase HⅡ酶。
6.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，荧光染料为SYTO 9，SYTO 13，SYTO 16，SYTO 24，SYTO 60，SYTO 62，SYTO 64，SYTO 82，SYBR Green I，SYBR Gold，YOPRO1，TOTO1，TOTO3，BOBO3，POPO3
7.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
8.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述检测包括以下步骤：
9.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述药物性耳聋基因1555A>G突变的判断依据为：
10.一种如权利要求1所述的引物探针组合物、如权利要求2–9任一项所述的体系在药物性耳聋基因诊断中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测药物性耳聋基因的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测1555a位点的第一引物组和检测1555g位点的第二引物组，其中外引物f3、外引物b3、环引物lf、环引物lb、fip引物为共同的；
2.一种检测药物性耳聋基因的体系，其特征在于，所述体系包括如权利要求1所述的引物组合物。
3.根据权利要求2所述的体系，其特征包括lamp引物、lna修饰的blocker探针、dntp、缓冲液、bst聚合酶、rnase hii、石蜡油、甜菜碱和ddh2o。
4.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述dna模板的用量为1～5μl。
5.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，所述酶溶液为bst dna聚合酶和rnase hⅱ酶。
6.根据权利要求3所述的体系，其特征在于，荧光染料为syto 9，syto 13，syto 16，syto ...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁敏，谭杰峰，张晓清，付英豪，蒋寅聪，常进龙，贾媛媛，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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