【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，具体涉及稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法。
技术介绍
1、γδt细胞作为一种重要的固有免疫细胞，在机体的免疫监视方面发挥重要作用，由于其体外诱导扩增不需要特异性的变异抗原和mhc分子的辅助，对多种类型的肿瘤细胞都具有较高的杀伤活性，因而成为免疫治疗研究中的重要课题。由于γδt细胞能够识别磷酸化抗原，因此常用的γδt细胞的扩增培养方法主要通过添加能够影响细胞代谢的药物，如唑来膦酸，使细胞内磷酸化的抗原累积水平升高；也有直接添加磷酸化抗原类物质活化刺激γδt细胞，可以是人工合成的磷酸化抗原类物质，如溴醇焦磷酸(bromohydrinpyrophosphate，brhpp)，或细菌等微生物合成的磷酸化抗原类物质，如(e)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦基-磷酸盐(hmbpp)。上述方法均需要同时使用较高剂量的白细胞介素2(il-2)，导致细胞容易进入凋亡状态，使得γδt细胞的扩增培养时间有限，扩增能力低，获得的细胞数量有限，且细胞杀伤活性也相对较弱。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，提高了γδt细胞的扩增能力，延长γδt细胞持续稳定扩增的时间，且增强了γδt细胞的免疫杀伤活性。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术所述的稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，包括以下步骤：
4、(1)提取单个核细胞：将血液样品离心，上层血浆备用，下层血细胞通过fi
5、(2)制备细胞培养液：向rpmi1640培养基中，加入步骤(1)分离的血浆、唑来膦酸和il-2；
6、细胞培养液中，血浆的体积百分比为5％，唑来膦酸的终浓度为1μm，il-2的终浓度为400u/ml。
7、(3)接种细胞：将步骤(1)提取的单个核细胞进行洗涤，调整细胞浓度，接种于步骤(2)制备的细胞培养液中，得到γδt细胞培养体系；
8、细胞浓度为2×106个/ml。
9、(4)前期培养：根据细胞生长状态向细胞培养体系中补充细胞培养补充液，培养至体系中γδt细胞数量占比大于85％。
10、(5)后期培养：向体系中添加经辐照过的raji细胞和双特异性抗体cd3×cd19，培养至体系中无raji细胞时，再次向培养体系中添加经辐照过的raji细胞和双特异性抗体cd3×cd19；再次培养至体系中无raji细胞时，培养完成，收集细胞，洗涤后重悬，即可得到γδt细胞制品；
11、raji细胞的辐照剂量为30gy，raji细胞购自中国科学院细胞库，cd3×cd19购自美国安进公司；
12、步骤(5)中，培养体系中，细胞总数与添加的经辐照过的raji细胞数量的比例为6:1，cd3×cd19的终浓度为500ng/ml，前后两次添加raji细胞和cd3×cd19的量均如上。
13、细胞培养补充液为含有il-2和血浆的rpmi1640培养基，其中，血浆的体积百分比为5％，il-2的浓度为200u/ml，血浆来源于步骤(1)提取的血浆，步骤(4)和步骤(5)的细胞培养过程中，均需要根据细胞生长状态补充细胞培养补充液。
14、洗涤液为生理盐水，洗涤次数2-3次。
15、细胞计数检测采用流式细胞分析技术。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
17、1.本专利技术所述方法培养γδt细胞的扩增期长，最终获得的细胞成品数量是传统培养方法的2-3倍；同时，培养得到的γδt细胞的细胞体积大，免疫杀伤活性显著高于传统方法培养的γδt细胞。
18、2.本专利技术在γδt细胞的扩增培养过程中，联合应用双特异性抗体cd3×cd19和饲养细胞，饲养细胞由于其支持、营养或提供刺激信号等作用，已经被用于某些特殊细胞特别是多能干细胞及nk细胞的体外培养，显示出较佳的辅助效果。本专利技术采用淋巴瘤细胞raji作为饲养细胞，能够提供γδt细胞活化增殖所需的刺激信号，促进细胞活化增殖。作为能够同时结合不同抗原表位的抗体，双特异性抗体能够同时结合效应细胞(γδt细胞)和靶细胞(raji细胞)，拉近效靶细胞的距离，延长其接触作用时间，从而有助于饲养细胞充分向γδt细胞提供活化增殖信号。随着扩增培养系统中cd3×cd19和饲养细胞的适时补充，充分活化的γδt细胞得以持续而稳定地增殖。该扩增体系中的γδt细胞与普通扩增的γδt细胞相比表现出体积大、增殖快、杀伤活性强等特征。
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1.一种稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，血浆的体积百分比为5％。
3.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，唑来膦酸的终浓度为1μM。
4.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，IL-2的终浓度为400U/mL。
5.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：步骤(3)中，细胞浓度为2×106个/mL。
6.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：细胞培养补充液为含有IL-2和血浆的RPMI1640培养基。
7.根据权利要求6所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：细胞培养补充液中，血浆的体积百分比为5％，IL-2的浓度为200U/mL。
8.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：步骤(5)中，Ra
9.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：步骤(5)中，细胞总数与添加的经辐照过的Raji细胞数量的比例为6:1。
10.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，其特征在于：步骤(5)中，CD3×CD19的终浓度为500ng/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，血浆的体积百分比为5％。
3.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，唑来膦酸的终浓度为1μm。
4.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，il-2的终浓度为400u/ml。
5.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，其特征在于：步骤(3)中，细胞浓度为2×106个/ml。
6.根据权利要求1所述的稳定扩增高杀伤活性γδt细胞的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭庆明，解西河，于兰，赵鹏，赵晓雯，王晔，
申请(专利权)人：青岛市中心医院，
类型：发明
国别省市：
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