【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转基因动物，特别涉及医学试验用途的一种过表达mr-1转基因肺腺癌小鼠模型及其构建方法。
技术介绍
1、肌原纤生成调节因子mr1(myofibrillogenesis regulator 1)为中国协和医科大学医药生物技术研究所代谢工程室克隆发现的基因。定位于2q35,mrna全长755bp,编码一段142个氨基酸组成的蛋白质,在心肌、骨骼肌、肾和肝中高表达。该基因与发作性非运动源性运动障碍基因(paroxysmal nonkinesigenic dyskinesia,pnkd)三条转录剪接异构体中最短的pnkd-3在定位和序列上几乎完全一致。因此，本专利技术所述过表达mr-1转基因肺腺癌小鼠模型也可以称为过表达pnkd转基因肺腺癌小鼠模型。
2、肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌的一种，属于非小细胞癌,不同于鳞状细胞肺癌,肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者,发病率比鳞癌和未分化癌低。
3、肺腺癌患者体内存在过表达mr-1基因，因此通过检测mr-1基因可以诊断肺腺癌，通过抑制mr-1基因可以治疗肺腺癌。在动物体内复制肺腺癌并构建过表达mr-1基因的模型，可以为肺腺癌的诊断和治疗提供医学试验模型，可以用于靶向治疗药物的筛选。
4、目前肺腺癌实验动物造模常用以下几种：
5、1.肿瘤细胞移植模型：将肺腺癌细胞移植到小鼠皮下形成肿瘤。这种模型可以通过选择不同的肺腺癌细胞系来模拟不同的亚型和突变情况。优点是易于建立和操作，能够快速形成肿瘤。缺点是缺乏肿瘤的微
6、2.化学诱导模型：使用化学物质(如致癌物质)诱导小鼠发生肺腺癌。这种模型可以模拟某些环境因素对肺腺癌发生的影响。优点是相对简单易行，能够模拟环境暴露导致的肺腺癌。缺点是化学物质的选择和剂量需要仔细控制，可能无法完全模拟人类肺腺癌的多样性。
7、3.基因工程小鼠模型：通过基因编辑技术(如crispr/cas9)或转基因技术来引入肺腺癌相关基因的突变或过表达。现在最常用的就是引入kras-g12d等位基因突变和p53功能缺失突变基因，以此来构建肺腺癌小鼠模型。缺点是建立和维护这些模型需要较长的时间以及肺腺癌的发生率仍然较低。
技术实现思路
0、
技术实现思路
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1、本专利技术提供一种过表达mr-1转基因肺腺癌小鼠模型及其构建方法。
2、本专利技术所述方法可以提高肺腺癌小鼠构建成功率，使发病时间提前，缩短实验周期，并准确地模拟人类肺腺癌的发展过程。
3、为此，本专利技术提供一种过表达mr-1转基因肺腺癌小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4、步骤一、pnkd基因敲入模式小鼠构建；
5、步骤二、ckp小鼠的获得；
6、步骤三、步骤二的ckp小鼠和步骤一的pnkd基因敲入小鼠交配；
7、步骤四、用他莫昔芬诱导基因型改变。
8、优选的，本专利技术所述的方法，其特征在于，其中步骤一、pnkd基因敲入模式小鼠构建，步骤如下：
9、1)sgrna设计和载体构建：根据靶位点区域的设计原则，设计cas9/sgrna并将sgrna连入带有t7启动子的质粒载体中。进行体外转录，通过酶切鉴定和测序确认打靶载体的构建完成；
10、2)小鼠受精卵注射：将cas9/sgrna打靶载体进行显微注射到小鼠受精卵中，以构建pnkd基因敲入小鼠；
11、3)f0代鼠尾基因型鉴定和交配：从f0小鼠中选择基因型鉴定结果为阳性的小鼠与野生型小鼠进行交配，以获得具有稳定基因型的f1代小鼠；
12、4)f1代小鼠基因型鉴定和表达检测：对f1代小鼠进行基因型鉴定，可以使用rt-pcr和southern blot技术对pnkd基因的表达进行检测。筛选出具有稳定基因型的f1代小鼠，然后进行留种繁殖，以获得pnkd过表达转基因的f1代小鼠；
13、优选的，本专利技术所述的方法，步骤二、ckp小鼠的获得，步骤如下：
14、将sftpc-cre/ert2小鼠和kraslsl-g12d-trp53(lsl-r172h)小鼠进行交配，获得了含有sftpc-cre/ert2和kraslsl-g12d-trp53(lsl-r172h)基因的小鼠，ckp小鼠；
15、优选的，本专利技术所述的方法，步骤三、步骤二的ckp小鼠和步骤一的pnkd基因敲入小鼠交配，步骤如下：
16、将ckp小鼠和pnkd基因敲入小鼠进行交配，以获得同时具有sftpc-cre/ert2、kraslsl-g12d-trp53(lsl-r172h)和pnkd基因的小鼠；
17、优选的，本专利技术所述的方法，步骤四、用他莫昔芬诱导基因型改变，步骤如下：
18、将他莫昔芬腹腔注射到步骤四得到的小鼠，连续注射5天，每天一次。
19、本专利技术所述的方法，其特征在于，
20、步骤一采用的sgrna序列为:5’-aaggccgcacccttctccggagg-3’
21、在构建过程中，必要时可以对f1代小鼠进行基因型鉴定，采用的鉴定引物如下：
22、
23、本专利技术所述的方法，其特征在于，
24、步骤二、在构建过程中，必要时可以对sftpc-cre/ert2基因表达进行基因型鉴定，使用的引物序列如下：
25、 sftpc-wt-f catccaacatacagacaacgc sftpc-wt-r ctatcctaaaagcccaatccta sftpc-cre-3-f tgcttcacagggtcggtag sftpc-cre/ert2-r1 gcccaaatgttgctggatag。
26、本专利技术所述的方法，其特征在于，在构建过程中，必要时可以对步骤四得到的小鼠进行基因检测的步骤。
27、本专利技术进一步提供本专利技术所述的方法构建的转基因小鼠。
28、本专利技术进一步提供本专利技术所述的方法构建的转基因小鼠用于生物医学研究。
29、特别优选的，本专利技术的方法，步骤如下：
30、步骤一、pnkd基因敲入模式小鼠构建：
31、1)sgrna设计和载体构建：根据靶位点区域的设计原则，设计本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种过表达MR-1转基因肺腺癌小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤一、PNKD基因敲入模式小鼠构建，步骤如下：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在构建过程中，必要时可以对步骤四得到的小鼠进行基因检测的步骤。
6.权利要求1的方法构建的转基因小鼠。
7.权利要求6的转基因小鼠用于生物医学研究。
【技术特征摘要】
1.一种过表达mr-1转基因肺腺癌小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤一、pnkd基因敲入模式小鼠构建，步骤如下：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
4...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵午莉，邵荣光，蔡美莲，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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