【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种组织型纤溶酶原激活剂tpa或其突变体的ctp融合蛋白及其制备工艺以及其在医疗上的应用。
技术介绍
1、组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tpa)是纤溶酶原激活剂的一种，主要由血管内皮细胞合成和释放，存在于哺乳动物的血浆中，是一种丝氨酸蛋白酶。tpa高效特异的与血栓中的纤维蛋白结合，所产生的tpa-纤维蛋白复合物能够快速高效地激活血凝块中的纤溶酶原，产生纤溶酶，使纤维蛋白降解成可溶性产物，达到溶解血栓，使栓塞的血管重新畅通的目的。tpa与纤维蛋白特异性结合后，其激活纤溶酶原的活性相较于游离状的tpa提高100倍，同时由于正常血液中极少有纤维蛋白生成，因此tpa不会使正常人发生系统性纤溶状态。高效、特异的溶栓性能使tpa成为治疗栓塞性疾病的理想药物。但由于tpa容易与血液中的纤溶酶原激活抑制剂(pai)形成复合物而丧失活性，同时因为可与肝细胞膜上的特异性受体结合而导致其半衰期仅4～6分钟，这就使得其用于溶栓时具有一定的局限性。由于存在以上问题影响溶栓效率，为达到治疗效果，tpa的治疗剂量高达100～150mg，而高剂量就增加了由系统性纤溶引起的出血风险。而通常情况下脑缺血开始发病后需要在3小时以内输入tpa才能达到治疗效果，超过时间窗后使用反而会增加出血风险，治疗时间窗短，也在一定程度上限制了tpa的使用。
2、基于tpa存在的药代动力学特性差，给药方式复杂，给药时间长，出血风险高，治疗时间窗短的问题，研究人员从结构入手，利用基因工程手
3、然而，虽然tnkase的溶栓效率相较于天然tpa已大幅提升，半衰期和治疗窗口期也已大大延长，但在临床实践中，仅有少数病人能够在几小时内接受溶栓治疗，且溶栓时仍存在一定的出血风险，因此需要进一步提高tpa的溶栓效率，降低出血风险，延长tpa变体在体内的半衰期且尽可能获得拓宽的治疗时间窗。
4、由于tpa的空间结构较为复杂也较为脆弱，蛋白翻译后保证正确折叠，形成有活性的空间构象进而保持tpa的酶活性较为困难，其中tpa的c-末端的丝氨酸结构域与其功能密切相关，在tpa的c端进行改造时面临着更大的挑战。正因如此，对于tpa的长效化改造多集中于对其进行突变体改造，对其c端的改造鲜有报道，仅有少数现有技术报道了使用igg抗体fc片段、人血清白蛋白has在tpa或其突变体的c端进行融合改造。
5、综上所述，在现有技术基础上，开发一种全新的稳定的tpa或其变体的c端融合蛋白以提升现有tpa药物的治疗活性，延长其半衰期，获得拓宽的治疗时间窗，减少纤维蛋白原的消耗，降低潜在的出血风险具有重要价值。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种tpa或其突变体的ctp融合蛋白，其相较于现有tpa药物溶栓效果更好，pai-1亲和性更低，热稳定性更高，纤维蛋白原消耗更少，半衰期更长，潜在出血风险更低。
2、为了实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，其结构为tpa-(l-ctp)n，其中l为柔性肽接头或不存在，n为1～4的整数，tpa为天然tpa或具有相似功能的tpa变体，ctp为人hcgβ羧基末端肽序列或其突变体，ctp通过或不通过柔性肽接头连接到tpa的c端。
3、进一步地，ctp为人hcgβ羧基末端肽，其氨基酸序列为sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:1)。
4、ctp可以增加重组融合蛋白唾液酸含量，唾液酸能增加黏蛋白的黏度，遮蔽蛋白上的糖链，使其不被糖苷酶水解，保护蛋白质免受蛋白酶降解，同时可提高蛋白糖基化程度，增加分子量，因此可以延长药物的体内半衰期。同时由于ctp是人体自身的肽序列，因此免疫原性非常低。
5、进一步地，tpa是具有相似功能的tpa变体tnk-tpa或tnka-tpa，tnk-tpa的氨基酸序列如seq id no:2所示；tnka-tpa的氨基酸序列如seq id no:3所示。
6、进一步地，柔性肽接头含有1-20个氨基酸，选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。
7、优选地，柔性肽接头的氨基酸序列为(ggggs)m，其中m为1～4的整数。
8、更优选地，柔性肽接头氨基酸序列为ggggs(seq id no:4)。
9、进一步地，柔性肽接头不存在。
10、进一步地，n为1或2。
11、进一步地，所述重组蛋白结构为tnk-tpa-(ctp)2，氨基酸序列如seq id no:5所示。
12、进一步地，所述重组蛋白结构为tnka-tpa-ctp，氨基酸序列如seq id no:6所示。
13、另一方面，本专利技术提供编码以上所述的重组蛋白的dna序列。
14、进一步地，所述的dna序列编码所述重组蛋白tnk-tpa-(ctp)2，如seq id no:7所示。
15、进一步地，所述的dna序列编码所述重组蛋白tnka-tpa-ctp，如seq id no:8所示。
16、再一方面，本专利技术提供一种载体，该载体包含以上所述的编码上述重组蛋白的dna序列。
17、再一方面，本专利技术提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体。
18、本专利技术所述的宿主细胞是指通过基因工程手段或者其它方法使其包含本专利技术所述载体、核酸序列或者蛋白序列的各种具有生物学意义的细胞及其它可能的形式。
19、进一步地，所述的宿主细胞是cho的衍生细胞株。
20、再一方面，本专利技术提供一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂以及有效量的以上所述的重组蛋白。
21、再一方面，本专利技术提供一种上述重组蛋白的制备方法。该制备方法采用上述宿主细胞制备上述重组蛋白。
22、再一方面，本专利技术提供一种上述重组蛋白在制备用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白，结构为tPA-(L-CTP)n，其中L为柔性肽接头或不存在，n为1～4的整数，tPA为天然tPA或具有相似功能的tPA变体，CTP为人hCGβ羧基末端肽序列或其突变体，CTP通过或不通过柔性肽接头连接到tPA的C端。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的CTP的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的tPA是具有相似功能的tPA变体TNK-tPA或TNKA-tPA，所述的TNK-tPA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的TNKA-tPA的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，L为柔性肽接头，所述的柔性接头含有1～20个氨基酸，选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸；优选所述的柔性肽接头的氨基酸序列为(GGGGS)m，其中m为1～4的整数；更优选所述的柔性肽接头氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，n为1或2。
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。