【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵，具体涉及一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体及湿菌体制备d-阿洛酮糖的方法。
技术介绍
1、d-阿洛酮糖(d-psicose)是一种稀有己酮糖，与d-果糖互为同分异构体。由于d-阿洛酮糖在医疗、保健等方面具有显著功效，在2011年被正式列入gras(公认安全，generallyrecognized as safe)食品。其甜度约为蔗糖的70％，但能量较低，具有低吸收、低卡路里等特性，可作为蔗糖的食用性替代品。此外，d-阿洛酮糖具有抑制肥胖，降血糖，降血脂等功能，非常适用于糖尿病患者和肥胖人群的食用，因此在医疗、保健方面具有显著功效。随着对其研究的不断推进，d-阿洛酮糖越来越受到广泛的关注。
2、目前生产d-阿洛酮糖的方法主要是生物转化法，生物转化法中，通过d-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化d-果糖的c-3位置的差向异构化制备d-阿洛酮糖有许多优势，例如简单的纯化过程和较高的产物浓度。现有技术中多为对d-阿洛酮糖3-差向异构酶进行基因重组或克隆的异源表达以及细胞的固定化的研究，而目前生产d-阿洛酮糖3-差向异构酶仍存在酶活较低，半衰期短、生产时间长、成本高等问题。中国专利cn111518853a提供了一种利用全细胞转化合成d-阿洛酮糖的方法，该专利以d-果糖为底物，加入atp、金属离子以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体，经过催化反应后再加热，加入酸性磷酸酶经过脱磷酸反应，通过该工艺d-阿洛酮糖的转化率可达到83％以上，最高可达到93％。但该方法所能够获得的菌泥量较少，在发酵控制和培养基方
3、在江南大学魏玉霞的关于“d-阿洛酮糖-3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达及固定化”中提供了一种固定d-阿洛酮-3-差向异构酶的方法，但固定化细胞酶回收率不高，固定化材料中海藻酸钠和二氧化钛价格较高，极大的提高了生产成本。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，原料成本低，增加了菌丝量，进而提高了d-阿洛酮糖的转化率。
2、为解决上述第一个技术问题，本专利技术的技术方案是：
3、一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
4、a：将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌在lb平板培养基上35～38℃划线培养16～20h，得平板挑选单克隆；
5、b：将步骤a中平板挑选单克隆接种于lb液体培养基，210～230rpm，35～38℃下培养，至菌液od600值为1.6～1.8，得培养菌液；
6、c：将步骤b中的培养菌液接种到种子罐中，种子培养基的初始ph为6.5～7.5，初始空气流量为0.4～0.6m3/l，维持压力为0.01～0.03mpa，发酵温度36～38℃，转速为180～220rpm进行培养；
7、培养过程中根据溶氧调节空气流量，保持do值在40％以上，培养至菌液od600值为3～4，得种子液；
8、d：将步骤c中的种子液接种到发酵罐中，发酵培养基的初始ph为6.5～7.5，初始空气流量为0.4～0.6m3/l，维持压力为0.01～0.03mpa，发酵温度36～38℃，转速为380～420rpm进行发酵；
9、发酵过程中补充补料液，保持do值为20～30％，培养至菌液od600值为25～35，加诱导剂l-阿拉伯糖，28～32℃恒温诱导10～14h，2800～3200rpm离心收集，得d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体。
10、步骤a中的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌为中国专利cn111518853a方法得到的重组大肠杆菌seq id no:1，具体的基因序列为：
11、atgaagcacggcatctactatagctactgggagcatgaatggagcgc gaagtttggcccgtacatcgaaaaggtggcgaagctgggcttcgatatcatcgaagtggccgcgcaccacatcaacgagtatagcgatgcggaactggccaccattcgcaagagtgcgaaggataacggcatcattctgaccgccggcattggcccgagtaagaccaagaatctgagcagtgaagatgccgcggttcgtgccgcgggcaaagcctttttcgaacgcacgctcagcaacgtggccaaactggacatccacaccatcggcggcgccctccatagctactggccaatcgattacagccagccggtggataaagcgggtgattatgcccgcggcgttgaaggcatcaacggcatcgcggacttcgccaacgatctgggcattaatctgtgcattgaggtgctcaaccgcttcgagaaccacgttctgaacacggcggccgaaggcgttgccttcgtgaaggacgtgggcaaaaacaacgtgaaggttatgctggatacctttcacatgaacatcgaagaagacagcttcggcgacgccattcgtacggcgggtccactgctgggccatttccacaccggcgaaagcaatcgccgcgttccgggcaaaggtcgcatgccgtggcatgaaatcggtctggcgctgcgcgacatcaactacaccggtgccgtgattatggaaccgttcgtgaagacgggcggcaccattggtagcgatatcaaagtgtggcgcgatctgagtggcggtgccgatattgccaagatggatgaggatgcccgcaacgcgctggcctttagccgctttgtgctgggcggttaa。
12、优选的，步骤c中培养菌液的接种量为种子培养基重量的0.5～2wt％。
13、优选的，步骤c中种子培养基为酵母粉4～6g/l、蛋白胨9～11g/l、甘油2～5g/l。
14、优选的，步骤d中诱导剂l-阿拉伯糖的添加量与发酵培养基体积的比例为1.0～2.0g/l。
15、优选的，步骤d中发酵培养基为柠檬酸1～3g/l、磷酸二氢钾12～16g/l、磷酸氢二钾4～6g/l、硫酸钾3～6g/l、甘油55～65g/l、硫酸镁0.4～0.8g/l。
16、优选的，步骤d中补料液为甘油550～650g/l、硫酸镁1～3g/l，其余为去离子水。
17、优选的，步骤d中种子液的接种量为发酵培养基重量的5～10wt％。
18、本专利技术所要解决的第二个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供利用d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体制备d-阿洛酮糖的方法，d-阿洛酮糖的转化率高。
19、为解决上述第二个技术问题，本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤C中培养菌液的接种量为种子培养基重量的0.5～2wt％。
3.如权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤C中种子培养基为酵母粉4～6g/L、蛋白胨9～11g/L、甘油2～5g/L。
4.如权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤D中诱导剂L-阿拉伯糖的添加量与发酵培养基体积的比例为1.0～2.0g/L。
5.如权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤D中发酵培养基为柠檬酸1～3g/L、磷酸二氢钾12～16g/L、磷酸氢二钾4～6g/L、硫酸钾3～6g/L、甘油55～65g/L、硫酸镁0.4～0.8g/L。
6.如权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿
7.如权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤D中种子液的接种量为发酵培养基重量的5～10wt％。
8.一种利用权利要求1-7中任一项所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的一种利用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步骤E中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体与底物的加入比为90～110g/L，所述镁盐为硫酸镁、硝酸镁或氯化镁中的一种。
...【技术特征摘要】
1.一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤c中培养菌液的接种量为种子培养基重量的0.5～2wt％。
3.如权利要求1所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤c中种子培养基为酵母粉4～6g/l、蛋白胨9～11g/l、甘油2～5g/l。
4.如权利要求1所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤d中诱导剂l-阿拉伯糖的添加量与发酵培养基体积的比例为1.0～2.0g/l。
5.如权利要求1所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤d中发酵培养基为柠檬酸1～3g/l、磷酸二氢钾12～16g/l、磷酸氢二钾4～6g...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱理平，徐良平，马旭，陈科材，
申请(专利权)人：东台市浩瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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