【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化合成，具体而言，涉及一种固定化海因酶的制备方法以及固定化海茵酶合成普瑞巴林关键手性中间体( r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸中的应用。
技术介绍
1、癫痫是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病，据相关资料显示，癫痫已经成为神经科的第二大常见病。普瑞巴林作为一种治疗癫痫的药物，具有良好的治疗效果。普瑞巴林本身属于钙离子通道调节剂，通过对钙通道调节，进一步降低钙离子进入神经末梢，减少谷氨酸和去甲肾上腺素等兴奋性神经递质的过度释放，抑制神经冲动的产生，以达到对神经病理性疼痛以及相关神经性疾病的治疗效果。与传统药物相比，普瑞巴林的服用剂量更低、次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强。普瑞巴林合成的关键在于手性中心的合成，，目前普瑞巴林方法多为化学合成方法，存在合成路线长、反应条件苛刻，产物或者中间体ee值不合格等诸多缺陷。相比化学合成，脂肪酶或者海茵酶参与的普瑞巴林合成路径短，原子利用率低，绿色环保，feixia liu和de-feng li等（green chem., 2022, 24, 4748）报道了来源于 bacillus stearothermophilus sd-1菌株的d-海茵酶（bshase），可催化3-异丁基戊二酰亚胺发生水解，产物ee值仅为38%，通过定点突变可提高ee值到99%；专利cn111944856b使用海茵酶催化合成普瑞巴林关键中间体( r)
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术目的是提供一种固定化载体，将海茵酶突变体共价固定化获得固定化酶的制备方法，以及该固定化酶在制备普瑞巴林药物手性中间体的应用。
2、利用固定化技术固定化海茵酶，提高机械剪切力的耐受性，避免细胞过多蛋白释放至反应体系，降低对产物纯化工艺造成的影响，以增强海茵酶的稳定性，达到生物酶催化剂循环利用，进一步简化后处理工艺，提高收率。因此需寻找不同固定化载体对海茵酶进行固定化，找出固定化海茵酶的最佳载体，在不影响其催化活性前提下，达到固定化酶最大套用次数。
3、技术方案：本专利技术基于 agrobacterium tumefaciens bql9（ a.tumefaciens bql9）菌株的天然d-海茵酶而改进的海茵酶突变体，利用不同的固定化载体对海茵酶突变体进行固定化，催化前体3-异丁基戊二酰亚胺生成( r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，反应式如下：
4、
5、本专利技术提供了一种以氨基树脂为载体，将海茵酶突变体共价固定化获得固定化海茵酶的制备方法，即固定化海茵酶，该固定化海茵酶的酶活回收大于90%，以固定化海茵酶作为催化剂进行普瑞巴林药物手性中间体的制备，其底物浓度可达到140g/l，反应22h转化率可达到98%以上，( r)-型产物ee值可达到100%，固定化海茵酶的重复利用22次，转化率均大于95%。
6、本专利技术的技术方案是，一种固定化海茵酶，其特征在于所述固定化酶是按照下述方法制备：
7、酶液制备：将seq id no: 1所示氨基酸序列对应的编码基因（核苷酸序列为seqid no: 2）重组质粒转化至大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于ph7.5-8.5的缓冲液得到菌悬液，经细胞破碎、离心得到海茵酶粗酶液。
8、湿菌体的制备：将海茵酶基因工程菌接种至终浓度50μg/ml硫酸卡那霉素抗性的lb培养基，37℃、200rpm下培养4h，为一级种子液；将上述种子液以体积浓度10%接种量接种至新鲜lb培养基，同样条件培养4h，为二级种子液，将二级种子液以体积浓度10%接种量接种至新鲜发酵培养基中，培养合适菌体浓度后，加入终浓度为0.2 mm的iptg，25℃下诱导培养16h，收集全细胞沉淀，即获得含海茵酶全细胞。
9、树脂活化：将氨基树脂用ph7.0-8.5缓冲液置于20℃摇床1h，抽滤的滤饼；将滤饼置于2%的戊二醛缓冲液中，于20℃摇床1h，抽滤后用去离子水洗涤载体至水清。
10、固定化酶制备：海茵酶粗酶液中加入活化后氨基树脂，氨基树脂的添加量为20g/100ml粗酶液；置于恒温摇床15-30℃、150-250rpm条件下固定化12h-24h，抽滤后滤饼用ph7.0-9.0的缓冲液淋洗两次，即得上述固定化海茵酶。
11、本专利技术方法采用共价固定化技术，可实现固定化海茵酶的高效制备，所得固定化转氨酶应用以制备普瑞巴林手性中间体。所得固定化海茵酶酶活回收率高、稳定性好、可重复回收利用。
12、所述缓冲液为ph 7.0-9.0缓冲液为tris-hcl、三乙醇胺-hcl缓冲液，优选ph 8.0的tris-hcl缓冲液；
13、固定化酶制备过程中ph为7.0~9.0，优选8.0；
14、菌悬液浓度为150g/l-250g/l，优选为200g/l；
15、固定化温度为15℃~45℃，优选25℃；
16、pei浓度为0.05%~0.4%，优选0.4%；
17、本专利技术中，所述树脂为西安蓝晓科技公司生产氨基树脂，型号为lx-1000ha。
18、本专利技术除海茵酶固定化的制备方法外，还涉及所述的固定化海茵酶在普瑞巴林手性药物中间体的应用。
19、具体的，所述应用为：以固定化海茵酶为催化剂、3-异丁基戊二酰亚胺为底物、氯化锰为酶激活剂，于ph 8.0、0.1mm tris-hcl缓冲液中进行水解，期间使用氢氧化钠维持体系ph 8.0，在45℃-51℃、300rpm条件下反应16-24h，制得普瑞巴林药物手性中间体( r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。上述氯化锰用量为0.02-0.08 g/g、固定化海茵酶用量为0.2-1 g/g、底物浓度140g/l。
20、本专利技术中产物转化率检测方法如下：
21、仪器：thermo u3000 system hplc
22、色谱柱：welch c18， 4.6mm×150mm，5μm
23、检测波长：220 nm；
24、流速：1.0 ml/min；
【技术保护点】
1.一种固定化海茵酶的制备方法，其特征在于海茵酶粗酶液中加入活化后氨基树脂，在15-30℃条件下固定化12h-24h，抽滤后滤饼用pH 7.5-8.5的缓冲液淋洗，即得固定化海茵酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于粗酶液与树脂按质量比为5:1投料。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于固定化温度为25℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于固定化pH为8.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于固定化缓冲液为0.1M Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于将活化后的氨基树脂加入终浓度不高于0.4%的PEI进行修饰。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于修饰温度为25℃。
8.一种权利要求1或6任一制备方法得到的固定化海茵酶的应用，其特征在于固定化海茵酶催化3-异丁基戊二酰亚胺水解为(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于固定化酶与催化底物的投料质量比为0
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于催化温度为45-50℃，催化反应pH为8.0。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化海茵酶的制备方法，其特征在于海茵酶粗酶液中加入活化后氨基树脂，在15-30℃条件下固定化12h-24h，抽滤后滤饼用ph 7.5-8.5的缓冲液淋洗，即得固定化海茵酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于粗酶液与树脂按质量比为5:1投料。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于固定化温度为25℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于固定化ph为8.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于固定化缓冲液为0.1m tris-hcl缓冲液。
6.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：丛日刚，夏俊刚，李招，穆家康，孙静，苗华明，
申请(专利权)人：迪嘉药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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