【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株、构建方法及其应用，属于生物学。
技术介绍
1、齐墩果酸（oleanolic acid，oa）是在女贞子、葡萄、油橄榄、牡丹等植物中存在的一种五环三萜类化合物，有降低血糖、抗癌、抗氧化等生理活性，其保肝作用在临床中应用广泛。目前，oa的主要生产方式是植物提取，存在植物生长占地面积大、生长周期长等局限性。随着生物技术的蓬勃发展，人们已完成植物中oa合成途径的解析，并已通过分子操作手段完成了上述途径基因在微生物细胞中的异源表达，实现了生物法合成齐墩果酸的目标，这种方式具有绿色无污染、成本较低等优势。但是，因植物基因与微生物底盘细胞往往存在表达系统不适配的问题，使得微生物合成oa的产量仍较低，远远达不到产业化生产的要求。经前期调研，专利技术人发现主要有两方面原因：1）传统代谢优化策略包括功能基因的敲入、旁路非必需基因的敲除、旁路必需基因的表达削弱等“刚性”优化手段，往往会对底盘菌株的生长造成损害，进而影响异源代谢物的生产；2）传统代谢优化更加关注于局部代谢流，无法从全局的角度找寻更佳的基因改造位点。
2、具体地，已有的可提高细胞生长与异源合成兼容性的代谢改造策略均存在一定的局限性。其中，常用的策略是针对局部代谢通路的静态或动态兼容。例如，想要让工程菌高产一种化合物，往往会对该化合物合成代谢所用的酶对应的基因上游启动子替换为可控的启动子，让菌株先生长，“菌多势众”后再通过控制特定配体的添加或生成诱导该基因的表达，实现先生长后生产的效果。但是，该方法需要研究者通过深刻的经验认知和多次试错
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株、构建方法及其应用。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下。
3、高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，对产齐墩果酸（oa）酿酒酵母生产菌株进行细胞全局代谢流模拟计算，确定使产齐墩果酸提产的靶向基因，然后通过基于丙二酰辅酶a诱导调控的反向转录方式对靶向基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
4、优选的，所述产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为酿酒酵母工程菌株saccharomycescerevisiae oa07。
5、优选的，所述靶向基因为fol3、abz2或pha2。
6、优选的，所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母r_3a，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27606。
7、优选的，所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母r_5a，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27607。
8、本专利技术所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，方法步骤包括：
9、（1）以产齐墩果酸（oa）酿酒酵母生产菌株为出发菌株，构建出发菌株的基因组规模代谢网络模型（gem）；
10、（2）运用全局代谢流优化算法optknock对所述模型进行模拟计算确定靶向基因；
11、（3）以所述靶向基因作为基因沉默位点，构建丙二酰辅酶a诱导的反义转录对出发菌株的基因沉默位点进行阶段性表达沉默，使菌株生长与生产代谢流震荡变化，最终获得高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
12、优选的，步骤（1）中，基于出发菌株的基因信息，向yeast8中添加与齐墩果酸相关的代谢反应、转运反应及代谢物信息，构建出发菌株的基因组规模代谢网络模型。
13、优选的，步骤（2）中，在optknock计算前，删除通量为零的反应、与基因不相关的反应和对细胞生长必需的反应。
14、优选的，步骤（3）中，在出发菌株中引入了丙二酰辅酶a相关的转录因子fapr，该转录因子为丙二酰辅酶a诱导型启动子ptdh3-bs23的抑制型反式作用元件，其调控作用受丙二酰辅酶a的抑制；然后，在丙二酰辅酶a合成基因acc1的3’端反向插入启动子ptdh3-bs23，构建丙二酰辅酶a诱导的反义转录操作元件，使acc1的合成受丙二酰辅酶a抑制；最后，在出发菌株基因沉默位点的3’端也反向插入启动子ptdh3-bs23，构建得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
15、本专利技术所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株在生产齐墩果酸中的应用。
16、有益效果
17、本专利技术提供的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，基于optknock算法对出发菌株细胞全局代谢流模拟计算，获得可使目标产物提产的靶向基因，然后通过基于诱导调控的反向转录方式对这些基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，从而实现目标产物阶梯式积累的目的。
18、相较于出发菌株oa07，本专利技术构建的菌株r_3a、r_5a在摇瓶级别分批补料发酵时的oa产量提升极为显著，高密度发酵至第4天，r_3a的oa积累量高达1232.19±36.75 mg·l-1，为目前报道的最高产量菌株。
19、本专利技术提出的基于全局代谢计算的动态代谢途径调控策略可有效提升酿酒酵母生产植物天然产物oa的能力，是一种有效的工程菌改造方法。
20、本专利技术建立了一个基于底盘细胞全基因组代谢网络的约束性计算方法，通过理论设计与实验测试，实现了细胞生长与长或短异源途径产物生产动态偶联的效果。进一步地，利用该方法实践操作，理性构建出了可稳定高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，证明了该方法在指导细胞工厂分子构建的可行性。
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1.高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：对产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株进行细胞全局代谢流模拟计算，确定使产齐墩果酸提产的靶向基因，然后通过基于丙二酰辅酶A诱导调控的反向转录方式对靶向基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
2. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为酿酒酵母工程菌株Saccharomyces cerevisiae OA07。
3.如权利要求2所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述靶向基因为fol3、abz2或pha2。
4. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母R_3A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27606。
5. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母R_5A，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2760
6.高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：方法步骤包括：
7. 如权利要求6所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，基于出发菌株的基因信息，向Yeast8中添加与齐墩果酸相关的代谢反应、转运反应及代谢物信息，构建出发菌株的基因组规模代谢网络模型；所述产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为酿酒酵母工程菌株Saccharomyces cerevisiae OA07。
8.如权利要求7所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，在OptKnock计算前，删除通量为零的反应、与基因不相关的反应和对细胞生长必需的反应。
9.如权利要求8所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，在出发菌株中引入了丙二酰辅酶A相关的转录因子FapR，该转录因子为丙二酰辅酶A诱导型启动子PTDH3-BS23的抑制型反式作用元件，其调控作用受丙二酰辅酶A的抑制；然后，在丙二酰辅酶A合成基因ACC1的3’端反向插入启动子PTDH3-BS23，构建丙二酰辅酶A诱导的反义转录操作元件，使ACC1的合成受丙二酰辅酶A抑制；最后，在出发菌株基因沉默位点的3’端也反向插入启动子PTDH3-BS23，构建得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
10.如权利要求1~5所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株在生产齐墩果酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：对产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株进行细胞全局代谢流模拟计算，确定使产齐墩果酸提产的靶向基因，然后通过基于丙二酰辅酶a诱导调控的反向转录方式对靶向基因实现阶段性表达沉默，实现菌株的生长与生产代谢流震荡变化，得到高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。
2. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述产齐墩果酸酿酒酵母生产菌株为酿酒酵母工程菌株saccharomyces cerevisiae oa07。
3.如权利要求2所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述靶向基因为fol3、abz2或pha2。
4. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母r_3a，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27606。
5. 如权利要求1所述的高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母r_5a，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27607。
6.高产齐墩果酸的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于：方法步骤包括：
7. 如权利要求6所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡冰，吕波，张莹，李笑寒，周蔷，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：
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