【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪繁殖和呼吸综合征病毒(prrsv)的检测，更具体地讲，本专利技术涉及一种猪蓝耳重组假病毒(prrsv假病毒)及其制备方法。
技术介绍
1、猪繁殖和呼吸综合征(prrs)是猪经济学上最重要的疾病之一。20世纪80年代后期，该综合征几乎同时在北美和西欧出现，并且已自此在欧洲、亚洲和美洲的主要猪生产国蔓延变为地方病。prrs的病源性因子是已被命名为prrs病毒或prrsv。对于欧洲和北美的prrs，该疾病特征为母猪和小母猪繁殖失败(新近术语流产、死产和干尸)、在幼猪当中高死亡率和所有年龄的猪中的呼吸道疾病。本病在世界各国引发了空前的“流产风暴”，给世界养猪业造成巨大的经济损失。prrsv使猪群发生严重免疫抑制，导致猪瘟、猪伪狂犬病等防控困难，同时继发感染病毒性与细菌性疾病，死亡率高，现已成为困扰我国规模化猪场养猪业的主要疫病之一。
2、prrsv属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，有囊膜的单股正链rna病毒，与其同属的病毒有鼠乳酸脱氢酶病毒(ldv)、马动脉炎病毒(eav)和猴出血热病毒(shfv)等。prrsv的基因组全长约15kb，含有8个开放阅读框(orfs)。每一个阅读框编码特异性病毒蛋白。根据病毒基因组核苷酸序列的不同将prrsv分为2个基因型，即美洲型和欧洲型，前者以atcc vr2332株为代表株，后者以lelystad virus(lv)为代表株。prrsv感染多数频繁发生于呼吸道，病毒在鼻内黏膜、呼吸系统的巨噬细胞和淋巴细胞中完成最初的复制，接着引起病毒血症以及病毒在全身的扩散。p
3、进一步加强病原监测，做好疫苗免疫、饲养管理、生物安全等综合防控，是持续降低猪群猪繁殖和呼吸综合征的有效途径。因此，鉴别诊断是控制prrsv感染的关键。
4、使用优质、经济的prrsv阳性对照品作为prrsv rna提取、逆转录、pcr反应的参照物，可以提高检出率，降低漏检率，对于临床prrsv的防控具有重要意义。
5、prrsv检测时，有以下三个主要步骤需要阳性参照:
6、1.从标本中提取prrsv rna，包括:病毒外膜、核衣壳打开/破碎，核酸释放；
7、2.prrsv rna被逆转录(也称反转录)为cdna；
8、3.cdna与pcr反应液和dna多聚酶混合，在pcr仪中扩增并得到信号。
9、现有的阳性参照，主要有下述几种来源:病猪肺组织匀浆液；体内或体外转录rna；质粒或化学合成。
10、所有阳性参照中，最准确贴切的阳性参照应该是含该prrsv病毒的天然样本(病猪肺组织)，同质性可充分保证其作为前述三个步骤的阳性参照，但其缺陷在于天然样本来源少，且由于含有天然病毒，因此具有传染性和危害性。
11、要克服天然病毒来源少且具有传染性的缺点，本质上可通过离体培养来解决，即把prrsv(尤其是基因组经过无害化改造的prrsv)导入合适的人工培养宿主细胞系，重组prrsv颗粒即可从细胞中产生并分泌至培养基上清。然而，这种prrsv生产方法存在若干缺陷，如成本高、病毒数量仍然较低、重复性差等。
12、体外转录的prrsv rna，因为它与标本中待测指标一样，都是rna，因此可以作为逆转录的阳性参照；但是，由于其不具备病毒外壳，因此不适合作为从标本中提取病毒rna操作的阳性参照。
13、用质粒作为阳性参照，其优点是制备纯化容易，但由于质粒是闭合环状超螺旋双链形式，非单线性，不是rna，因此它只能作为pcr参照，而无法作为rna提取和逆转录的参照。
14、至于化学合成法制备rna阳性参照，其生产成本高，还会因为没有核衣壳、膜的保护而容易降解，因此到目前为止还无实际应用的报道。
15、因此，有必要提供一种prrsv的人工假病毒，其不需要把prrsv或经过无害化改造的prrsv导入人工培养宿主细胞系，以降低成本，同时还能够作为阳性参照和标准品。
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术目的是提供一种易于获得、安全且廉价的prrsv的人工假病毒制备方法，为prrsv的检测及诊断提供一种安全、高效的标准品。
2、为了实现上述的专利技术目的，一方面，本专利技术提供了一种猪蓝耳重组慢病毒载体，该猪蓝耳重组慢病毒载体是通过将标准ncbi参考序列中所含有的编码gp5蛋白的基因序列片段重组入ph iv-hbpxe-egfp质粒载体所得到的phiv-hbpxe-egfp-prrsv表达载体。
3、要获得适合作为阳性对照或标准品的prrsv的人工假病毒,合适的目的序列选取是关键，目的序列的选取主要需要考虑以下几个方面的因素：首先,目的序列的序列在各种不同基因型的prrsv中应该是保守的，即绝大多数基因型的prrsv，也就是绝大多数待检样品中的prrsv病毒，都具有这一段特定碱基序列；其次，对于pcr和病毒包装来说，片段越短效率越高，而对于模拟prrsv的目的/功能来说，则越接近基因组全长越有代表性。
4、综合考虑上述因素，本专利技术的专利技术人选取了标准ncbi参考序列中所含有的编码gp5蛋白的基因序列片段作为目的序列，选取该序列首先是因为该序列包含了prrsv基因组序列中相对最保守的序列，以此作为prrsv通用定量检测试剂盒的检测参数/指标/对象，可以提高检出率，降低漏检率。目前，主要的商用和实验室pcr检测方法都针对此区域；其次，该序列pcr和病毒包装效率高，与其它长片段相比，相对容易亚克隆进假病毒载体phiv-hbpxe-egfp，且其对应的病毒产率高达1012copies/μl左右，其滴度、稳定性、灵敏度等均能满足要求。
5、在本专利技术的猪蓝耳重组慢病毒载体中，所提及的标准ncbi参考序列是指seq id:mt163314.1的参考序列。
6、优选地，在本专利技术的猪蓝耳重组慢病毒载体中，所采用的编码gp5蛋白的基因序列片段为seq id no:1所示的dna片段；根据标准ncbi参考序列sequence id:mt163314.1，该碱基序列为prrsv病毒14285到15170位的序列,其含有编码gp5蛋白的基因序列。
7、优选地，在本专利技术的猪蓝耳重组慢病毒载体中，所采用的phiv-hbpxe-egfp质粒载体的dna序列如seq id no:2所示。
8、进一步优选地，在本专利技术的猪蓝耳重组慢病毒载体中，所采用的phiv-hbpxe-egfp-prrsv表达载体的dna序列如seq id no:3所示。
9、另一方面，为了实现上述的专利技术目的，本专利技术还提供了一种制备猪蓝耳重组假病毒的方法，该方法包括如下步骤：
10、(1)构建上述的猪蓝耳重组慢病毒载体phiv-hbpxe-egfp-prrsv本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述猪蓝耳重组慢病毒载体是通过将标准NCBI参考序列中所含有的编码GP5蛋白的基因序列片段重组入pHIV-HBPXE-EGFP质粒载体所得到的pHIV-HBPXE-EGFP-PRRSV表达载体。
2.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述的标准NCBI参考序列为SEQID:MT163314.1。
3.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述编码GP5蛋白的基因序列片段为SEQ ID NO:1。
4.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述pHIV-HBPXE-EGFP质粒载体的DNA序列为SEQ ID NO:2。
5.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述pHIV-HBPXE-EGFP-PRRSV表达载体的DNA序列为SEQ ID NO:3。
6.一种制备猪蓝耳重组假病毒的方法，该方法包括如下步骤：
7.如据权利要求6所述的制备方法，其中，步骤(2)中，所述假病毒包装质粒为psPAX2；所述包膜质粒为pMD2.G。
8
9.如权利要求8所述的猪蓝耳重组假病毒，其中，所述假病毒包装质粒为psPAX2；所述包膜质粒为pMD2.G。
10.一种猪蓝耳重组假病毒标准品，其中，该猪蓝耳重组假病毒标准品含有权利要求8或9所述的猪蓝耳重组假病毒。
...【技术特征摘要】
1.一种猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述猪蓝耳重组慢病毒载体是通过将标准ncbi参考序列中所含有的编码gp5蛋白的基因序列片段重组入phiv-hbpxe-egfp质粒载体所得到的phiv-hbpxe-egfp-prrsv表达载体。
2.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述的标准ncbi参考序列为seqid:mt163314.1。
3.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述编码gp5蛋白的基因序列片段为seq id no:1。
4.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述phiv-hbpxe-egfp质粒载体的dna序列为seq id no:2。
5.如权利要求1所述的猪蓝耳重组慢病毒载体，其中，所述phiv-hbpxe-egfp...
【专利技术属性】
技术研发人员：王星晨，熊福银，林淑鈺，张玮，吴俊果，
申请(专利权)人：广州市益豚猪业投资有限公司，
类型：发明
国别省市：
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