【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪病毒的检测，更具体地讲，本专利技术涉及一种pdev(猪流行性腹泻病毒)、pdcov(猪德尔塔冠状病毒)、rv-a(猪轮状病毒a型)三重荧光定量rt-qpcr检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)是nidovirales冠状病毒科α冠状病毒属的一种，可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率。pedv是具有包膜的单股正链rna病毒，基因组大小约28kb，直径为95-190nm。pedv对小肠造成损伤，产生消化和吸收不良，最终导致腹泻和脱水，引起哺乳仔猪死亡。该病毒感染率高，造成的仔猪死亡率高。在过去的30年里，这种疾病在欧洲和亚洲的养猪业被报道，1970年代末，该病毒首次出现在英格兰(wood,e.n.,1977.an apparently new syndrome of porcineepidemic diarrhoea.vet.rec.100(12),243-244)和比利时(pensaert,m.b.,de bouck,p.,1978.a new coronavirus-like particle associated with diarrhea inswine.arch.virol.58(3),243-247)。pedv于2013年在美国首次报道(stevenson,g.w.,hoang,h.,schwartz,k.j.,burrough,e.b.,sun,d.,madson,d.,cooper,v.l.,pill
2、2014年在美国腹泻猪中检测到一种新型猪德尔塔型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,pdcov)，其临床表现与pedv相似(wang,l.,byrum,b.,zhang,y.,2014a.detection and genetic characterization of delta-coronavirus in pigs,ohio,usa,2014.emerg.infect.dis.20(7),1227-1230)，也可以对哺乳仔猪小肠造成损伤，产生消化和吸收不良，最终导致腹泻和脱水，引起哺乳仔猪死亡，但死亡率比pedv感染所导致的哺乳仔猪死亡率低(30％-40％)。
3、轮状病毒属呼肠病毒科，可以引起猪只腹泻，是一种双链rna病毒。其双链rna基因组可以编码六个结构蛋白(vp1-vp4，vp6，vp7)和五个非结构蛋白(nsp1-nsp5/6)。根据vp6蛋白的抗原关系，轮状病毒可以分为10型(a-j)(estes,m.；greenberg,h.b.rotaviruses.in fields virology,5 ed.；knipe,d.m.,howley,p.,eds.；wolterskluwer health/lippincott williams&wilkins:philadelphia,pa,usa,2013；pp.1347-1395；matthijnssens,j.,otto,p.h.,ciarlet,m.,et al.vp6-sequence-based cutoffvalues as a criterion for rotavirus species demarcation.arch.virol.2012,157,1177-1182)。其中，引起猪只腹泻的最常见轮状病毒是rva，其发病率为3.3％-67.3％，无明显季节性(marthaler,d.,homwong,n.,rossow,k.,et al.rapid detection and highoccurrence of porcine rotavirus a,b,and c by rt-qpcr in diagnosticsamples.j.virol.methods 2014,209,30-34)。
4、上述三种猪肠道冠状病毒的流行传播可以对养猪业造成巨大损失，其引起的临床症状难以区分，而且经常存在混合感染、继发感染的问题，故增加了猪群的发病率和死亡率，严重危害养猪业的健康发展。进一步加强病原监测，做好疫苗免疫、饲养管理、生物安全等综合防控，是持续降低猪群病毒性腹泻的有效途径。因此，鉴别诊断是控制猪病毒性流行性腹泻的关键。
5、腹泻常规pcr检测方法存在通量低、耗时长和检出率低等缺点。可以实现高通量分析的毛细管电泳法，通过引物设计，不同的病原体可扩增不同长度的dna片段，将扩增产物从pcr仪取出后转移至毛细管电泳分析仪中分析扩增片段长度，不同长度dna片段电泳速度不同，可在同一反应体系内直接对样本进行多种腹泻病原体的同步检测和分析，从而区分不同的病原体。但是该方案的不足之处为：1.引物设计复杂；2.检测过程耗时较长，需先提取核酸，再pcr扩增，再毛细管电泳分析片段长度进而分析可能感染的病原体；3.如若引物设计不够合理，不同目的基因扩增片段长度相差过小，则会因为电泳中的漂移问题，无法有效判断扩增片段的大小，进而带来检测误差。
6、单重实时荧光定量pcr只能针对单个靶基因进行检测，存在效率低、成本高，不能经济高效地提供临床需要的检测结果。
7、pdev(猪流行性腹泻病毒)、pdcov(猪德尔塔冠状病毒)、rv-a(猪轮状病毒a型)都可以引起猪腹泻，但常规的病原学和血清学检测很难将这些疾病同时加以区别鉴定。常规检测方法存在操作繁琐、费时费力、灵敏度低、检测成本高等缺陷，尤其是多种病毒感染时，难以有效进行早期检测鉴别，容易产生误判错判。特别是当多种猪腹泻病毒混合感染时，更需要一个准确有效的方法来区分不同病毒。
8、因此，有必要提供一种多重rt-qpcr检测试剂盒，其能在单一反应体系中同时对多个靶标基因进行检测，从而大大减少检测工作量，提高效率，降低成本，同时也可降低反复多次加样可能带来的污染。
【技术保护点】
1.一种对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV-A)同时进行三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括：用于扩增PEDV目标基因片段的引物组、用于检测PEDV的探针；用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组、用于检测PDCoV的探针；以及用于扩增RV-A目标基因片段的引物组、用于检测RV-A的探针；
2.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增PEDV目标基因片段的引物组和用于检测PEDV的探针为PEDV方案2。
3.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组和用于检测PDCoV的探针为PDCoV方案3。
4.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增RV-A目标基因片段的引物组和用于检测RV-A的探针为RV-A方案1。
5.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有淬灭基团。
6.如
7.如权利要求6所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于检测PEDV的探针的报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；用于检测PDCoV的探针的报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ3；用于检测RV-A的探针的报告基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。
8.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括酶反应液、腹泻三重PCR反应液、腹泻三重阳性对照、腹泻三重阴性对照。
9.如权利要求8所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述的腹泻三重阳性对照为带有PEDVN基因、PDCoVM基因和RV-ANSP5基因片段的阳性重组质粒标准品模板。
...【技术特征摘要】
1.一种对猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪德尔塔型冠状病毒(pdcov)、猪轮状病毒a型(rv-a)同时进行三重荧光定量rt-qpcr检测试剂盒，该试剂盒包括：用于扩增pedv目标基因片段的引物组、用于检测pedv的探针；用于扩增pdcov目标基因片段的引物组、用于检测pdcov的探针；以及用于扩增rv-a目标基因片段的引物组、用于检测rv-a的探针；
2.如权利要求1所述的三重荧光定量rt-qpcr检测试剂盒，其中，用于扩增pedv目标基因片段的引物组和用于检测pedv的探针为pedv方案2。
3.如权利要求1所述的三重荧光定量rt-qpcr检测试剂盒，其中，用于扩增pdcov目标基因片段的引物组和用于检测pdcov的探针为pdcov方案3。
4.如权利要求1所述的三重荧光定量rt-qpcr检测试剂盒，其中，用于扩增rv-a目标基因片段的引物组和用于检测rv-a的探针为rv-a方案1。
5.如权利要求1所述的三重荧光定量rt-qpcr检测试剂盒，其中，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玮，廖鏖，王星晨，熊福银，吴俊果，
申请(专利权)人：广州市益豚猪业投资有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。