本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻ＯｓＷＲＫＹ４５－２基因在抵抗非生物逆境胁迫中的功能验证。利用基于ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）原理的转基因技术，将ＯｓＷＲＫＹ４５－２基因的部分ＤＮＡ片段与能够表达双链ＲＮＡ的载体连接并转入水稻品种，抑制水稻品种中ＯｓＷＲＫＹ４５－２基因的表达。ＯｓＷＲＫＹ４５－２基因表达量降低的遗传转化水稻对干旱、高盐、低温和脱落酸的耐受能力显著增强，证明ＯｓＷＲＫＹ４５－２基因在水稻抵抗非生物逆境胁迫中是负调控因子。我们可以通过抑制ＯｓＷＲＫＹ４５－２基因表达培育耐干旱、高盐和低温以及对脱落酸不敏感的农作物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
具体涉及水稻0SWRKY45-2基因在水稻应对非生物胁迫反应中的功能验证和应用。0sWRKY45-2基因是水稻抗旱、抗盐和抗冷反应中的负调控因子。抑制0sWRKY45-2基因功能后，水稻应对干旱、高盐和低温的抗性能力显著提高。
技术介绍
农作物生产受到诸多环境因素的影响。干旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响农作物的生长，造成产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此， 培育抗逆农作物一直是农作物品种改良的主要目标之一。长期的进化选择，使植物形成了抵抗干旱、高盐、低温等逆境胁迫的自我保护机制。虽然目前人们对这种自我保护机制的调控机理的认识仍然有限，但是已知许多植物基因參与调控这ー自我保护机制(Seki，2007)。 植物激素也參与植物应对非生物逆境胁迫的调控,其中脱落酸(abscisic acid, ABA)在植物抵抗干旱、高盐、低温等逆境胁迫反应中发挥重要作用(Verslues and Zhu, 2005).作为基因转录调控蛋白，转录因子在各种逆境胁迫反应中具有重要的作用(Hu等，2006 ;Qiu等， 2008)。但是目前可用于农作物抗非生物逆境胁迫改良的优良基因资源非常有限。水稻是禾本科农作物中的重要模式植物。因为禾本科植物的染色体共线性关系 (Moore等，1995 ；Gale and Devos，1998)，禾本科植物间存在大量进化上同源的基因。这些进化上同源的基因在不同禾本科植物间可能參与调控相同或者相似的生理活动(Chen等， 2003)。因此，从水稻中分离逆境相关基因，并鉴定其在提高植物抗逆性方面所发挥的功能， 对于培育抗逆水稻和其他禾本科农作物新品种将具有非常重要的意义。本申请人于2008年10月21日提交了ー份0sWRKY45_2基因专利申请，其申请号为 200810197309. 9，(专利技术名称水稻抗病相关基因0sWRKY45_2和它在改良水稻抗病性中的应用)，公开号为CN101386856，公开日为2009年3月18日。该基因的序列为序列表SEQID NO 1所示，序列全长为1629bp。该0sWRKY45-2基因的编码区是序列表SEQ ID NO 1中第 113-1270位所示的核苷酸，该基因的功能是增加水稻对生物胁迫-白叶枯病菌和稻瘟病菌的抗性。
技术实现思路
本专利技术的目的是对已知0sWRKY45-2基因(专利申请公开号为CN101386856)新功能的进ー步鉴定。该基因的新功能是增强水稻在非生物逆境胁迫条件下(如干旱、高盐和低温胁)的耐受能力；通过抑制0sWRKY45-2基因的表达增强水稻抵抗干旱、高盐和低温的能力，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御干旱、高盐和低温的能力奠定基础。本专利技术所涉及的0sWRKY45_2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示。可以采用已经克隆的0sWRKY45-2基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本专利技术的基因或同源基因。同样，采用PCR技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本专利技术的0sWRKY45-2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。可以采用遗传转化技术抑制0sWRKY45-2基因的功能，产生同时抗干旱和低温的转基因植株。采用这种技术创造抗性植物是传统育种技术所不能达到的。本专利技术为增强水稻对非生物逆境胁迫的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将0sWRKY45-2基因的部分片段和与能够表达双链RNA (double strand RNA, dsRNA)的载体连接、转入水稻，通过抑制其自身0sWRKY45-2基因的表达改良水稻对非生物逆境胁迫的耐受能力。在本专利技术的实施例部分，我们阐述了 0sWRKY45_2基因在抗非生物逆境胁迫中的功能验证和应用过程。附图说明序列表SEQ ID NO :1.是本专利技术所涉及的0sWRKY45_2基因的DNA序列。图I.用定量RT-PCR技术分析水稻品种珍汕97在各种逆境和脱落酸处理下 0sffRKY45-2基因的表达变化。对照是未处理的样品。图2.抑制0SWRKY45-2基因表达的水稻植株(阳性)提高了对干旱的耐受能力。 “阴性”表示分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。图3.抑制0sWRKY45_2基因表达的水稻植株(阳性)提高了对高盐的耐受能力。 “阴性”表示分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。图4.抑制0sWRKY45_2基因表达的水稻植株(阳性)提高了对低温的耐受能力。 “阴性”表示分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照。图5.抑制0sWRKY45_2基因表达的水稻植株(阳性)降低了对脱落酸的敏感性。 “阴性”表示阴性转基因植株作为对照。具体实施方式本专利技术的前期研究工作结果提示水稻中的抗病相关基因0sWRKY45_2参与调控抗病反应(Tao等，2009)。已知有些水稻抗病相关基因(如0sWRKY13)除了参与调控抗病反应外，还具有其他功能(Qiu等，2008)。为了验证0sWRKY45-2基因是否还具有其他功能，产生了本专利技术。本专利技术所用水稻株系是抑制0sWRKY45_2基因表达的纯合转基因株系D115RMH1和 D115RMH6 (Tao等，2009)，用分别从这两个株系中分离出的阴性转基因植株作为对照；这两个株系具有籼稻品种明恢63的遗传背景，是采用RNA干扰技术抑制0sWRKY45-2基因的表达所产生的转基因材料(Tao等，2009)。已知该0sWRKY45-2基因序列如序列表SEQ ID NO: I所示。本专利技术所用抑制0sWRKY45-2基因表达的转基因株系是采用序列表SEQ ID NO :1中 204-421,513-617和719_1038bp处对应的一条cDNA序列(该条cDNA序列只是序列表SEQ ID NO :1中编码序列的一部分)、利用能够表达双链RNA的农杆菌介导的遗传转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化技术产生的(Tao等，2009)。产生这些转基因株系的载体的构建和遗传转化方法可参照相关文献(Tao等，2009)，限于篇幅本说明书不再展开描述。以下实施例中进一步定义本专利技术，根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可以对本专利技术做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例I :0sWRKY45_2基因在各种逆境反应下的表达模式分析我们选用籼稻品种Zhenshan 97 (Oryza sativa L. subsp. indica cv.)作为表达谱分析的材料。种子催芽后，在正常生长条件下培养至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是将生长在沙土中的植株缺水，分别在胁迫前、胁迫后3天、4天、6天取样。高盐胁迫是将幼苗由水培液移入含有200mmol/LNaCl的水培液中，分别在胁迫前，胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。低温胁迫是把水稻幼苗放入4°C人工气候室,分别于胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时和24小时取样。激素处理是用含有0. 02% Tween-20的 100 u M脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后，分别在胁迫前、胁迫后3小时、6小本文档来自技高网...
【技术保护点】
ＯｓＷＲＫＹ４５－２基因在增加植物耐干旱、高盐和低温以及对脱落酸不敏感中的应用，该基因的序列如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１６２９位对应的核苷酸所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王石平，陶增，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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