【技术实现步骤摘要】
本申请涉及细胞培养，具体涉及一种诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法。
技术介绍
1、干细胞是一种能够自我更新、分裂以及分化成其它细胞类群的细胞。从干细胞在发育中所处的阶段来看，干细胞可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是一种多能干细胞，可以无限增殖并分化成人体两百多种类型细胞、形成机体的组织和器官，即能分化成多种细胞和组织的潜能的干细胞。人工诱导的多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的分化能力、表观遗传修饰和细胞形态等其他特征，为干细胞的研究提供了新的思路。
2、目前，利用多能干细胞的诱导培养血管内皮细胞的内皮诱导培养基中往往含有动物源成分，如使用小鼠胚胎成纤维细胞、动物血清等。虽然上述培养基可以保证干细胞及其诱导分化的细胞具有优异的自我更新能力，但是由于内皮诱导培养基中引入大量动物源性物质，给干细胞及其诱导分化的细胞自我更新及分化过程带来了不确定因素，增加了误差；此外，目前已有的内皮诱导培养基的诱导效率偏低，导致血管内皮细胞的转化率低等。
3、因此，需要提供一种不含有动物源成分的内皮诱导培养基，并且该培养基能够为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，从而能够高效地将多能干细胞诱导分化形成血管内皮细胞。
技术实现思路
1、为了提高多能干细胞诱导分化成血管内皮细胞的转化率，本申请提供一种内皮诱导培养基。
2、第一方面，本申请提供一种内皮诱导培养基，采用如下的技术方案：
3、一种内皮诱导培养基，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，
4、b组分：0-300ng/ml bfgf、0-1.5mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸、0-60μm melatonin；
5、c组分：0-20μm dapt和0-4μm forskolin；
6、所述b组分与c组分的含量不同时为0。
7、本申请以e6培养基作为基础培养基，并通过添加必要组分：人血管内皮生长因子vegf165，以及其他组分：bfgf、8-溴腺苷-3,5-环单磷酸、melatonin、dapt等，获得了一种内皮诱导培养基，该培养基一方面不含有动物源成分，能够有效避免由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生；另一方面，上述培养基有效地将多能干细胞诱导分化为血管内皮细胞，细胞转化率能到达到85％以上，使得血管内皮细胞能够实现大规模的工业应用。
8、本申请中，vegf165为人血管内皮生长因子，vegf165能够诱导血管生成及内皮细胞生长，刺激内皮细胞进行有丝分裂与细胞迁移。bfgf为碱性成纤维细胞生长因子，是一个传递发育信号、能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，具有强烈的血管生成作用，bfgf在体外，能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原，同时具有维持多能干细胞分化潜能的作用。8-溴腺苷-3,5-环单磷酸是一种细胞渗透性环amp类似物。melatonin是一种mt receptor激动剂激素，melatonin与vegf信号通路相互作用，并显示出调节新生血管形成的活性。本申请通过实验探究发现，8-溴腺苷-3,5-环单磷酸与melatonin的添加量能够显著影响多能干细胞诱导分化为血管内皮细胞的转化率。dapt是一种γ-secretase抑制剂，并间接抑制γ-分泌酶底物notch的活性，进而影响细胞信号传导，维持高水平kdr启动子活性，提高细胞与vegfa165结合，促进向血管内皮分化能力。forskolin是从毛喉鞘蕊花中提取的一种天然产物，是腺苷酸环化酶激活剂，forskolin能够增加vegfa165的受体neuropilin1和kdr的表达，进而提高vegfa165的效果，对多能干细胞向血管内皮细胞的诱导分化有明显的促进作用，forskolin还可以增加细胞的camp水平，从而提高诱导分化的效率。
9、本申请中，多能干细胞可以为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
10、可选地，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/ml vegf165、100-300ng/ml bfgf、0.5-1.5mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸和40-60μmmelatonin。
11、在一个具体的实施方案中，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：300ng/ml vegf165、200ng/ml bfgf、1mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸和50μmmelatonin。
12、在一个具体的实施方案中，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：200ng/ml vegf165、300ng/ml bfgf、1.5mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸和50μmmelatonin。
13、可选地，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/ml vegf165、5-20μm dapt和1-4μm forskolin。
14、在一个具体的实施方案中，所述vegf165的含量可以为100ng/ml、200ng/ml或400ng/ml。
15、在一个具体的实施方案中，所述dapt的含量可以为5μm、10μm、15μm或20μm。
16、在一个具体的实施方案中，所述forskolin的含量可以为1μm、2μm、3μm或4μm。
17、可选地，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/ml vegf165、100-300ng/ml bfgf、0.5-1.5mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸、40-60μmmelatonin、5-20μm dapt和1-4μm forskolin。
18、在一个具体的实施方案中，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：300ng/ml vegf165、200ng/ml bfgf、1mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸、50μmmelatonin、15μm dapt和3μm forskolin。
19、在一个具体的实施方案中，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：300ng/ml vegf165、300ng/ml bfgf、1mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸、40μmmelatonin、10μm dapt和3μm forskolin。
20、第二方面，本申请提供一种诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法，该方法采用了前述内皮诱导培养基。
21、可选地，所述诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法，包括以下步骤：
22、(1)将多能干细胞于培养基a中诱导培养24h；
23、(2)更换培养基为e6培养基，诱导培养24h；
24、(3)更换培养基为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括E6培养基，还包括以下含量的组分：
2.根据权利要求1所述的内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括E6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/mL VEGF165、100-300ng/mL bFGF、0.5-1.5mM 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸和40-60μM Melatonin。
3.根据权利要求1所述的内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括E6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/mL VEGF165、5-20μM DAPT和1-4μM Forskolin。
4.根据权利要求1所述的内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括E6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/mL VEGF165、100-300ng/mL bFGF、0.5-1.5mM 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸、40-60μM Melatonin、5-20μM DAPT和1-4μM Forskolin。
5.一种诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化
6.根据权利要求5所述的诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法，其特征在于，所述培养基A为含有4-8μM CHIR99021的E6培养基；培养基B为包含8-12ng/mL VEGF165、8-12ng/mL bFGF和8-12μM氢化可的松的E6培养基。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤（1）进行之前，还需要对多能干细胞进行预处理，具体为：
9.根据权利要求8所述的诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法，其特征在于，所述E8培养基中Y-27632的含量为4-6μM。
10.根据权利要求8所述的诱导多能干细胞向血管内皮细胞分化的方法，其特征在于，所述重悬、培养采用的培养基为含有4-6μM Y-27632的E8培养基。
...【技术特征摘要】
1.一种内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：
2.根据权利要求1所述的内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/ml vegf165、100-300ng/ml bfgf、0.5-1.5mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸和40-60μm melatonin。
3.根据权利要求1所述的内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/ml vegf165、5-20μm dapt和1-4μm forskolin。
4.根据权利要求1所述的内皮诱导培养基，其特征在于，所述内皮诱导培养基包括e6培养基，还包括以下含量的组分：100-400ng/ml vegf165、100-300ng/ml bfgf、0.5-1.5mm 8-溴腺苷-3,5-环单磷酸、40-60μm melatonin、5-20μm dapt和1-4μm forskolin。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永兴，富尧，
申请(专利权)人：北京朴汇细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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