【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一种串联启动子、重组菌株及在重组大肠埃希菌寡糖合成中的应用，属于生物。
技术介绍
1、大肠埃希菌是目前研究得最清晰、分析得最全面的一种微生物，因其具有易于进行基因水平操作、遗传背景清楚、培养成本低等优点，一直作为表达外源基因的首选。研究发现可通过对大肠埃希菌基因组改造来对蛋白质进行定向修饰和控制，从而实现糖蛋白的均一性生产，这样可大大减少治疗性糖蛋白生产的成本。2019年，delisa课题组将空肠弯曲杆菌内的n-糖基化途径转移至大肠埃希菌基因组，单整合子的糖基化效率最高为90％(laura e.yates,et al.metabolic engineering,2019,53:59-68.)。另外，还有研究者通过优化寡糖基转移酶pglb的密码子使糖基化效率提高到了77％和101％(分别为westernblot和psrm两种检测方法得到的结果)。
2、为了优化大肠埃希菌底盘细胞生产n-糖基化蛋白的产量，通常需要对通路中每个关键基因的表达进行微调，可通过使用不同强度的启动子、核糖体结合位点或通过改变通路中每个基因的拷贝数等方法来实现，同时结合表达条件的优化以达到最佳产量。
3、启动子是基因转录的开关，在调节基因表达水平和重组代谢工程表达水平方面发挥重要作用。根据启动子的作用方式及功能可将其分为：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子难以对基因表达进行精细调控，另外，频繁使用时可导致遗传不稳定性。相对来说，诱导型启动子可通过诱导剂的添加精确控制基因表达，这在n-糖基化修饰过程中
4、tac启动子(tac promoter,ptac)是trp和lacuv5启动子拼接的杂合启动子，placuv5是较弱的诱导型启动子。由于后续构建的工程菌株所整合基因的拷贝数较质粒系统降低，通常需要重新替换成中、强启动子来加强表达。然后替换启动子的步骤繁杂，筛选效率低，极大限制了n-糖基化蛋白的合成效率。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种串联启动子、重组菌株及在重组大肠埃希菌寡糖合成中的应用，本申请通过替换启动子来调控糖苷供体合成基因簇，用于调控寡糖合成酶编码基因的表达，并将其整合至大肠埃希菌基因组，通过转入模式蛋白单质粒，获得了重组工程菌株，提高了n-糖基化蛋白的合成效率和稳定性。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案包括：
3、第一方面，本专利技术提供了一种串联启动子，所述的串联启动子为启动子ptac、启动子placuv5和启动子ptac串联。
4、进一步地，所述的启动子ptac的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述的启动子ptac-placuv5的核苷酸序列如seq id no:2所示。
5、进一步地，所述的启动子的核苷酸序列如seq id no:3所示。
6、第二方面，本专利技术提供了一种含有所述串联启动子的表达盒。
7、第三方面，本专利技术提供了一种含有所述串联启动子的重组载体。
8、第四方面，本专利技术提供了一种含有所述串联启动子的重组菌株。
9、进一步地，所述重组菌株为大肠埃希菌。
10、优选地，所述的大肠埃希菌为大肠埃希菌xl1-blue。
11、进一步地，所述的重组菌株为转化含有所述串联启动子的重组载体的宿主菌；或者所述的重组菌株是将含有所述串联启动子的表达盒整合至宿主菌的eca位点处获得。
12、第五方面，本专利技术提供了一种所述的串联启动子在重组菌株长效、高水平表达目标基因中的应用。
13、进一步地，所述的目的基因为寡糖链合成酶及转移酶。
14、上述寡糖链合成酶及转移酶可用于生产n-糖基化蛋白。
15、有益效果：ptac是一种强的杂合启动子，placuv5是弱的启动子，两者的多种结合可以更精细的调控目的基因的表达水平，尤其将其整合至基因组后，重组菌株的生物量随拷贝数的增加而增加，适用于微生物细胞工厂中其他高附加值化合物的平台菌株的构建。
16、本专利技术构建的重组菌株能在短期实现近100％的n-糖基化效率且糖蛋白的表达量相比于双质粒增加了约3.7倍，达到了900mg/l。本专利技术能够有效的提高糖蛋白的表达量，降低生产周期，并克服双质粒系统的不稳定性；同时便于寻找适合糖蛋白表达的启动子强度，从而有助于目的蛋白的低成本、快速生产。
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1.一种串联启动子，其特征在于，所述的串联启动子为启动子Ptac、启动子PlacUV5和启动子Ptac串联。
2.根据权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的启动子Ptac-PlacUV5的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
4.一种含有权利要求1-3中任一项所述串联启动子的表达盒。
5.一种含有权利要求1-3中任一项所述串联启动子的重组载体。
6.一种含有权利要求1-3中任一项所述串联启动子的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠埃希菌。
8.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为转化含有所述串联启动子的重组载体的宿主菌；或者所述的重组菌株是将含有所述串联启动子的表达盒整合至宿主菌的ECA位点处获得。
9.权利要求1-3中任一项所述的串联启动子在重组菌株
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的目的基因为寡糖链合成酶及转移酶。
...【技术特征摘要】
1.一种串联启动子，其特征在于，所述的串联启动子为启动子ptac、启动子placuv5和启动子ptac串联。
2.根据权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子ptac的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述的启动子ptac-placuv5的核苷酸序列如seq id no:2所示。
3.根据权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如seqid no:3所示。
4.一种含有权利要求1-3中任一项所述串联启动子的表达盒。
5.一种含有权利要求1-3中任一项所述串联启动子的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁宁，包紫鑫，胡学军，高玉亭，吴琼，张小梅，郑洋，叶冬梅，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：
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