【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种基于pcr结合crispr-cas12a方法的嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)显色可视化检测试剂，及试剂盒、应用、检测装置和检测方法。
技术介绍
1、嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)广泛存在于世界各地的水体以及患病鱼类、食品和动物粪便中，是重要的水生和人畜共患病原体，可引起水产养殖动物败血症等疾病，导致养殖鱼类大规模死亡，给水产养殖业带来巨大经济损失。嗜水气单胞菌感染人类可导致胆膜炎、急性肠胃炎等感染性疾病，对水产品质量安全以及人类健康构成威胁。因此，病原体的早期检测对于预防和控制这些感染尤为重要。
2、现有技术中针对嗜水气单胞菌的检测方法有许多种，例如，carnahan等采用传统的病原菌培养与生化鉴定技术对60株临床分离菌鉴定准确率达97％(58/60)，对18株atcc气单胞菌准确率为100％，该方法虽然准确但耗时耗力，而且需要专业技术人员，无法满足现场快速检测的需求。斑点印迹法、单克隆抗体等免疫学检测方法虽然节省了时间，但抗体制备以及商业化免疫测试盒的成本较高，不易在养殖场普及。多重pcr、实时荧光pcr以及基因测序、生物传感器等新兴技术需要价格高昂的专业设备以及受培训过的专业技术人员，均不适合在资源有限的实验室或现场应用。
3、因此，目前亟需建立一种便携式、低成本、灵敏度高的适合现场快速检测嗜水气单胞菌的有效方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术旨
2、一方面，本申请提供了一种基于pcr结合crispr-cas12a方法的嗜水气单胞菌显色可视化检测试剂，所述试剂包括：
3、用于pcr特异性扩增嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)气溶素aera基因(seq id no：1)的引物对，所述引物对的序列如下：
4、上游引物1-fw：5’-catagggataggagatgtcagccttgtagagc
5、(seq id no：2)-3’，
6、下游引物1-rv：5’-tgagcgagaaggtgaccaccaagaaca(seq id no：3)-3’；
7、用于引导crispr-cas12a特异性识别切割所述气溶素aera基因的grna，所述grna的序列如下：
8、5’-uaauuucuacuaaguguagau uuaaguaucccuauccucua(seq id no：8)-3’，
9、具有g-四链体dna酶切割位点的g-四联体，其序列如下：
10、gggttttttgggttttttgggttttttggg(seq id no：12)。
11、在一种实施方式中，所述引物对在pcr反应体系中的浓度为9μm。
12、在一种实施方式中，在crispr-cas12a反应体系中，cas12a蛋白与所述grna的摩尔浓度比为1:0.8。
13、另一方面，本申请还提供了一种用于特异性检测嗜水气单胞菌的试剂盒，所述试剂盒含有所述的试剂。
14、在一种实施方式中，所述试剂盒还包括primer free反应缓冲液、cas12a蛋白、10×反应缓冲液、阳性对照物以及阴性对照物。
15、在一种实施方式中，所述阳性对照物为嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)atcc15947标准菌株提取的基因组dna，所述阴性对照物为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)atcc25922标准菌株提取的基因组dna。
16、另一方面，本申请还提供了所述的试剂和/或所述的试剂盒在以下i)～iii)任一种中的应用：
17、i)、非疾病诊断治疗目的地检测嗜水气单胞菌；
18、ii)、制备检测嗜水气单胞菌的产品；
19、iii)、筛选药物，所述药物用于预防嗜水气单胞菌感染、防治嗜水气单胞菌引起的疾病和/或抑制嗜水气单胞菌的增殖。
20、在一种实施方式中，所述试剂和/或试剂盒在应用时，pcr反应体系的组成包括：质量浓度为10μm的上游引物1-fw 1μl，质量浓度为10μm的下游引物1-rv 1μl，primer free反应缓冲液10ul，2ul嗜水气单胞菌基因组dna，depc水补足至20μl；和/或，
21、crispr-cas12a反应体系组成包括：4μl 10×反应缓冲液，质量浓度为10μm的cas12a蛋白0.4μl，质量浓度为2μm的grna 4μl，29.6μl h2o，1μlpcr扩增产物，质量浓度为10μm的g-四链体1μl；和/或，
22、显色反应体系组成包括：crispr-cas12a反应体系40μl，质量浓度为10μm的血红素5μl，2μl kcl、3μl h2o和50μl含h2o2的可溶性tmb底物溶液。
23、在一种实施方式中，所述试剂和/或试剂盒在应用时，pcr反应的扩增程序包括：95℃5min；95℃15s、55℃15s，72℃45s，40个循环；72℃反应7min；和/或，
24、在crispr-cas12a检测中，将反应体系混合于37℃下反应1小时，再通过在65℃加热10min终止反应；和/或，
25、在显色反应检测中，将显色反应体系于室温下在黑暗中反应20min，通过裸眼观察结果。
26、另一方面，本申请还提供了一种用于检测嗜水气单胞菌感染的装置，所述装置包括：
27、样品扩增模块：用于提取待测样本的基因组dna，使用所述的试剂和/或所述的试剂盒对所述基因组dna进行pcr扩增；
28、crispr-cas12a反应模块：用于对所述样品扩增模块获得的pcr产物进行crispr-cas12a反应；
29、显色模块：用于对所述crispr-cas12a反应模块获得的反应结束的体系进行显色反应检测；
30、结果分析模块：用于对显色反应结束后的反应体系颜色进行判定，当最终反应体系为无色时，判定为阳性；当最终反应体系为蓝绿色时，判定为阴性。
31、另一方面，本申请提供了一种非诊断目的地嗜水气单胞菌的检测方法，包括：
32、步骤1)、获得待测样本的基因组dna；
33、步骤2)、采用所述的试剂和/或所述的试剂盒对所述待测样本的基因组dna进行pcr扩增、crispr-cas12a反应和显色反应；
34、步骤3)、根据反应结果观察判定样本中是否含有嗜水气单胞菌的目标基因，当最终反应体系为无色时，判定为阳性；当最终反应体系为蓝绿色时，判定为阴性。
35、其中，crispr-cas12a基因编辑技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于PCR结合CRISPR-Cas12a方法的嗜水气单胞菌(Edwardsiella ictaluri)显色可视化检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述引物对在PCR反应体系中的浓度为9μM。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在CRISPR-Cas12a反应体系中，Cas12a蛋白与所述gRNA的摩尔浓度比为1:0.8。
4.一种用于特异性检测嗜水气单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1-3任一所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Primer Free反应缓冲液、Cas12a蛋白、10×反应缓冲液、阳性对照物以及阴性对照物。
6.如权利要求1-3任一所述的试剂和/或如权利要求4或5所述的试剂盒在以下I)～III)任一种中的应用：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒在应用时，PCR反应体系的组成包括：质量浓度为10μM的上游引物1-FW 1μL，质量浓度为10μM的下
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒在应用时，PCR反应的扩增程序包括：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃45s，40个循环；72℃反应7min；和/或，
9.一种用于检测嗜水气单胞菌感染的装置，其特征在于，所述装置包括：
10.一种非诊断目的地嗜水气单胞菌的检测方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种基于pcr结合crispr-cas12a方法的嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)显色可视化检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述引物对在pcr反应体系中的浓度为9μm。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，在crispr-cas12a反应体系中，cas12a蛋白与所述grna的摩尔浓度比为1:0.8。
4.一种用于特异性检测嗜水气单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1-3任一所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括primer free反应缓冲液、cas12a蛋白、10×反应缓冲液、阳性对照物以及阴性对照物。
6.如权利要求1-3任一所述的试剂和...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑秋月，高子惠，陈文锐，曹际娟，张晓波，曲心平，邵卓麒，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：
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