本申请涉及细胞生物学的技术领域，具体公开了一种新型多能干细胞及其制备方法和应用、利用该新型多能干细胞制备巨核细胞及血小板的方法。该制备方法具体包括以下步骤：向多能干细胞中转入第一个核苷酸序列组、第二个核苷酸序列组，获得新型多能干细胞；所述第一个核苷酸序列组包括：编码切割功能失活CRISPR/Cas蛋白（即dCas）的核苷酸序列；分别靶向GATA1基因、FLI1基因、TAL1基因以及RUNX1基因的sgRNA核苷酸序列；诱导型启动子核苷酸序列；所述第二个核苷酸序列组包括：组成型启动子核苷酸序列；编码转录因子的核苷酸序列。本申请提供的新型多能干细胞制备血小板，能够实现血小板的规模化稳定生产。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及细胞生物学的，更具体地说，涉及一种新型多能干细胞及其制备方法和应用、利用该新型多能干细胞制备巨核细胞及血小板的方法。
技术介绍
1、血小板是尤为重要的血液细胞之一，是血液凝固以及止血所必需的细胞。在白血病、骨髓移植、抗癌治疗等中，血小板不仅需求量多，而且需要稳定供给。迄今为止，一直采用由捐献者献血并从献血者的血液中获取血小板的方法来供给血小板。然而，由于长期献血者不足以及无法冷冻获取的血小板等缺陷，难以实现血小板的稳定供给。
2、为了确保血小板的供给，还尝试了给予患者tpo类似物制剂的方法、从脐带血或骨髓细胞分化巨核细胞的方法等。但是，给予患者tpo类似物制剂的方法，由于在给予患者tpo类似物制剂后，患者会产生对tpo类似物制剂的抗体而使其无效，因而该方法尚未实用化。另外，采用从脐带血或骨髓细胞分化巨核细胞的方法也只能够得到极少数成为巨核细胞来源的造血干细胞，因此，上述方法均不能实现稳定供给血小板。
3、基于上述，提供一种能够稳定供给血小板的方法是一个亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为了实现血小板的稳定供给，本申请提供一种新型多能干细胞及其制备方法和应用、利用该新型多能干细胞制备巨核细胞及血小板的方法。
2、第一方面，本申请提供一种新型多能干细胞的制备方法，采用如下的技术方案：
3、一种新型多能干细胞的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：向多能干细胞中转入第一个核苷酸序列组、第二个核苷酸序列组，获得新型多能干细胞；</p>4、所述第一个核苷酸序列组包括：分别靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因的sgrna核苷酸序列；编码切割功能失活crispr/cas蛋白(即dcas)的核苷酸序列；诱导型启动子核苷酸序列；
5、所述靶向gata1基因的sgrna核苷酸序列包含如seq id no.2所示的核苷酸序列；
6、所述靶向fli1基因的sgrna核苷酸序列包含如seq id no.9所示的核苷酸序列；
7、所述靶向tal1基因的sgrna核苷酸序列包含如seq id no.14所示的核苷酸序列；
8、所述第二个核苷酸序列组包括：组成型启动子核苷酸序列；编码转录因子的核苷酸序列。
9、本申请中，第一个核苷酸序列组还可以包括转录激活结构域蛋白的核苷酸序列，翻译后与失活cas蛋白形成融合蛋白，例如该融合蛋白可以是dcas9-vp64；sgrna具有发卡结构适配子，可以结合噬菌体外壳蛋白ms2，该ms2可与一个或多个转录激活结构域形成融合蛋白，例如该融合蛋白可以是ms2-p65或ms2-p65-hsf1。
10、本申请利用crispr/dcas9-sam系统对多能干细胞进行改造，向靶细胞内转入sgrna、ms2-p65-hsf1和dcas9-vp64，当这三种载体共转导细胞时，sgrna募集ms2/p65/hsf1和dcas9/vp64到sgrna靶位点，从而组装出有功能性的sam。这些sam可通过vp64、p65和hsf1激活结构域之间的协同相互作用实现靶位点的强烈转录激活。本申请中，靶基因为gata1基因、fli1基因和tal1基因，从而获得新型多能干细胞，在激活gata1基因、fli1基因和tal1基因的基础上，实现利用该新型多能干细胞制备血小板的目的。
11、此外，第一个核苷酸序列组还包括诱导型启动子核苷酸序。第二个核苷酸序列组包括组成型启动子核苷酸序列和编码转录因子的核苷酸序列，用于组成型表达转录因子，该转录因子能够特异性结合第一个核苷酸序列组中的诱导型启动子，从而诱导gata1基因、fli1基因和tal1基因的转录。
12、sgrna核苷酸序列的设计与选择是crispr/cas9技术的精髓，也是实验是否成功的关键一步，它决定了cas9的靶向性和特异性。研究表明，sgrna的长度及两条sgrna间的距离也可影响打靶效率。不同sgrna的切点之间的距离越近，效率越高。
13、本申请从众多特定靶向的sgrna核苷酸序列中进行筛选，当需要同时靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因时，分别选择上述的sgrna核苷酸序列，最终实现利用获得的新型多能干细胞高产血小板。
14、可选地，所述第一个核苷酸序列组还包括靶向runx1基因的sgrna核苷酸序列。
15、可选地，靶向runx1基因的sgrna核苷酸序列包含如seq id no.27所示的核苷酸序列。
16、本申请在分别选择上述的sgrna核苷酸序列靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因时，还进一步添加了靶向runx1基因的sgrna核苷酸序列，并对靶向runx1基因的sgrna核苷酸序列进行了筛选。基于上述技术方案，本申请能够再进一步提高利用新型多能干细胞高产血小板的能力。
17、可选地，所述分别靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因的sgrna核苷酸序列分别在独立启动子的控制下表达，并在独立终止子的控制下终止。
18、可选地，所述分别靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因的sgrna核苷酸序列和所述靶向runx1基因的sgrna核苷酸序列分别在独立启动子的控制下表达，并在独立终止子的控制下终止。
19、可选地，所述分别靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因的sgrna核苷酸序列同在一个启动子的控制下表达，生成一个单一的转录本；所述转录本编码多个sgrna，所述sgrna之间由rna切割序列分隔开。
20、可选地，所述分别靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因的sgrna核苷酸序列和所述靶向runx1基因的sgrna核苷酸序列同在一个启动子的控制下表达，生成一个单一的转录本；所述转录本编码多个sgrna，所述sgrna之间由rna切割序列分隔开。
21、可选地，所述rna切割序列为trna、ribozyme和csy4中的任意一种或多种。
22、可选地，所述rna切割序列为trna。
23、可选地，所述trna选自人的trna-leu、人的trna-arg、人的trna-gln核苷酸序列中的任意一种或多种。
24、可选地，所述trna选自人的trna-leu、人的trna-arg核苷酸序列中的任意一种或多种。
25、可选地，所述trna为人的trna-arg的核苷酸序列。
26、可选地，所述ribozyme为自切型核酶。
27、可选地，所述第一个核苷酸序列组和所述第二个核苷酸序列组分别整合在所述多能干细胞染色体中的不同位点处。
28、可选地，所述第一个核苷酸序列组的整合位点处为安全港aavs1位点；
29、可选地，所述第二个核苷酸序列组的整合位点处为安全港rosa26位点。
30、可选地，所述诱导型启动子核苷酸序列为四环素响应性启动子核苷酸本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种新型多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：向多能干细胞中转入第一个核苷酸序列组、第二个核苷酸序列组，获得新型多能干细胞；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一个核苷酸序列组还包括靶向RUNX1基因的sgRNA核苷酸序列；
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分别靶向GATA1基因、FLI1基因和TAL1基因的sgRNA核苷酸序列同在一个启动子的控制下表达，生成一个单一的转录本；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述RNA切割序列为tRNA、Ribozyme和Csy4中的任意一种或多种；
6.一种利用权利要求1-6中任一项所述的制备方法制得的新型多能干细胞。
7.一种权利要求7所述的新型多能干细胞的应用，其特征在于，所述新型多能干细胞用于制备血小板。
8.一种利用权利要求6所述的新型多能干细胞制备巨核细胞的方法，其特征在于，所述方法具体如下：培养所述新型多能干细胞，培养过程中添加诱导剂以及外源性细胞因子，产生巨核细胞。
9.一种利用权利要求6所述的新型多能干细胞制备血小板的方法，其特征在于，所述方法具体如下：培养所述新型多能干细胞，培养过程中添加诱导剂以及外源性细胞因子，产生巨核细胞，并利用巨核细胞产生血小板；
10.一种制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求9所述的方法制得的血小板。
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【技术特征摘要】
1.一种新型多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：向多能干细胞中转入第一个核苷酸序列组、第二个核苷酸序列组，获得新型多能干细胞；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一个核苷酸序列组还包括靶向runx1基因的sgrna核苷酸序列；
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分别靶向gata1基因、fli1基因和tal1基因的sgrna核苷酸序列同在一个启动子的控制下表达，生成一个单一的转录本；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述rna切割序列为trna、ribozyme和csy4中的任意一种或多种；...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永兴，富尧，
申请(专利权)人：北京朴汇细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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