本发明专利技术公开了一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，首先，设计亲水多肽；其次，合成固相亲水多肽(glycoHILIC)；最后合成固相糖肽，获得基于糖肽的亲水富集材料。该方法的优点为：glycoHILIC用于细胞样本中糖肽的富集与纯化；glycoHILIC分析疾病生物样本中异常糖基化的变化；glycoHILIC分析亲水分子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子分析试剂，具体涉及一种氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法。
技术介绍
1、蛋白糖基化在细胞和组织中具有重要的生物作用，异常糖基化影响细胞之间的相互作用并可改变细胞的功能。通过对细胞或临床样本的糖基化分析，可发现与疾病关联的异常糖基化特征，可用于疾病的早期诊断、治疗预后判断和潜在的治疗靶点。糖基化的分析通常使用自下而上的方法，即糖蛋白首先用蛋白酶酶解成为多肽和糖肽，再采用亲水结合或凝集素等富集糖肽，将多肽去除，从而大大提高糖肽在色谱分离后的离子化效率，排除多肽更容易离子化带来对糖肽鉴定的影响。亲水结合富集广泛应用于糖肽的分析，主要得益于其方法简易、处理时间短、所用溶剂与质谱兼容。目前已有的亲水结合材料包括氨甲酰(amide-80)、短链氨基酸材料(少于5个氨基酸)、天然产物(棉花)等。这些材料在富集糖肽上存在效率较低、选择性不高和均一性不理想等问题。为解决这些难题，我们根据氨基酸的属性，设计了全新亲水性氨基酸多肽，并将亲水聚糖结合到多肽上，全方位提高对糖肽亲水结合富集的效率、选择性和均一性。用亲水糖肽glycohilic材料可以实现对异常糖基化的糖蛋白定性定量分析。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，以解决现有技术中糖肽富集特异性和选择性的难题。
2、本专利技术的一种技术方案是：
3、一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，包括步骤：
>4、(1)设计亲水多肽；5、(2)合成固相亲水多肽；
6、(3)合成固相糖肽，获得基于糖肽的亲水富集材料。
7、进一步的，在步骤(1)中，所述亲水多肽的长度为10-20，所述亲水多肽的n-端的第一个氨基酸为g，c-端为k，所述亲水多肽的活性基团位为k，并且k的数量为大于或者等于2，所述亲水多肽为中性及带电荷氨基酸，且能够与亲水聚糖形成氢键，所述亲水多肽带有疏水氨基酸w和y。
8、进一步的，在步骤(2)中，所述合成固相亲水多肽具体为：将所述亲水多肽溶于pbs缓冲溶液中，选取具有醛基的固相，使所述亲水多肽中的甘氨酸与所述具有醛基的固相耦合，用nacnbh3还原胺化，得到具有稳定的酰胺键的固相亲水多肽。
9、进一步的，在步骤(3)中，所述合成固相糖肽，获得基于糖肽的亲水富集材料具体为：
10、将多糖dp7或者聚糖溶于dmso和乙酸，并加入nacnbh3，获得处理液；
11、将spe管底部用橡皮管密封，将所述处理液加入到所述固相亲水多肽中，获得样本；
12、将所述样本在65℃反应2-4小时；
13、去掉橡皮管，离心，去除上清液；
14、分别用乙醇、acn、nacl和去离子水分别清洗多次，获得基于糖肽的亲水富集材料。
15、进一步的，所述dmso和乙酸的体积比为7:3。
16、进一步的，在步骤(3)中，所述合成固相糖肽，获得基于糖肽的亲水富集材料具体为：
17、将多糖dp7或聚糖溶于乙酸钠溶液，加入naio4，在室温反应2-3小时，使得多糖或者聚糖开环形成具有醛基的溶液；
18、在所述具有醛基的溶液中加入1x pbs，将ph调至大于7，获得多糖或者聚糖；
19、将所述固相亲水多肽与所述多糖或者聚糖混合，此时多肽上的赖氨酸与醛基在室温反应4小时，获得样本；
20、在所述样本中加入nacnbh3，室温反应4-6小时；
21、将所述样本用acn、nacl和去离子水分别清洗多次，获得基于糖肽的亲水富集材料。
22、进一步的，所述naio4的最终浓度为10-20mm。
23、进一步的，所述nacnbh3的最终浓度为50mm。
24、本专利技术提供了一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其优点在于：
25、(1)固相亲水糖肽(glycohilic)用于细胞样本中糖肽的富集与纯化；
26、(2)有利于利用固相亲水糖肽分析疾病生物样本中异常糖基化的变化；
27、(3)有利于利用固相亲水糖肽分析亲水分子。
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【技术保护点】
1.一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述亲水多肽的长度为10-20，所述亲水多肽的N-端的第一个氨基酸为G，C-端为K，所述亲水多肽的活性基团位为K，并且K的数量为大于或者等于2，所述亲水多肽为中性及带电荷氨基酸，且能够与亲水聚糖形成氢键，所述亲水多肽带有疏水氨基酸W和Y。
3.根据权利要求1所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述合成固相亲水多肽具体为：将所述亲水多肽溶于PBS缓冲溶液中，选取具有醛基的固相，使所述亲水多肽中的甘氨酸与所述具有醛基的固相耦合，用NaCNBH3还原胺化，得到具有稳定的酰胺键的固相亲水多肽。
4.根据权利要求1所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述合成固相糖肽，获得基于糖肽的亲水富集材料具体为：
5.根据权利要求4所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于：所述DMSO和乙酸的体积比为7:3。
6.根据权利要求1所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述合成固相糖肽，获得基于糖肽的亲水富集材料具体为：
7.根据权利要求6所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于：所述NaIO4的最终浓度为10-20mM。
8.根据权利要求6所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于：所述NaCNBH3的最终浓度为50mM。
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【技术特征摘要】
1.一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述亲水多肽的长度为10-20，所述亲水多肽的n-端的第一个氨基酸为g，c-端为k，所述亲水多肽的活性基团位为k，并且k的数量为大于或者等于2，所述亲水多肽为中性及带电荷氨基酸，且能够与亲水聚糖形成氢键，所述亲水多肽带有疏水氨基酸w和y。
3.根据权利要求1所述的一种基于氨基酸亲水性及共价结合聚糖合成亲水富集材料的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述合成固相亲水多肽具体为：将所述亲水多肽溶于pbs缓冲溶液中，选取具有醛基的固相，使所述亲水多肽中的甘氨酸与所述具有醛基的固相耦合，用nacnbh3还原胺化，得到具有稳定的酰胺键的固相亲水多肽。
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨霜，陆朝晖，张鹏，肖文金，周雨锋，
申请(专利权)人：核工业总医院，
类型：发明
国别省市：
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