【技术实现步骤摘要】
本申请大体上涉及超分辨显微成像的，尤其涉及二维或三维超分辨光片荧光显微成像系统和方法。
技术介绍
1、近年来，生命科学研究对高时空分辨三维成像技术的需求与日俱增。实现对微观生命活动高分辨率、高速、低损伤、长时程的三维成像，对于探索生命活动机理、了解生理学和病理学信息等具有重要的实践意义和广泛的应用前景。
2、光学荧光显微成像技术作为一类重要观测手段，为生命科学研究的发展提供了有力支撑。光学荧光显微成像技术中的光片荧光显微成像(light-sheet fluorescencemicroscopy,lsfm)近年来在三维成像领域备受青睐，与传统的三维成像技术(例如激光扫描共聚焦显微镜、多光子荧光显微成像技术)不同，其利用薄的光片进行面激发，在垂直光片的方向上进行探测；这种面激发成像比传统的点扫描成像速度更快，通过配合高速扫描振镜、压电位移台等高精度器件，可实现快速的三维体成像。
3、但是，光片荧光显微成像本身成像分辨率受限且很难与超分辨显微成像技术相兼容。这主要是因为(1)在光片荧光显微成像系统中，激发物镜与探测物镜互相垂直的物理布置方式要求探测物镜具有较长的工作距离来实现成像，这就限制了探测物镜的数值孔径(numerical aperture,na)的选择范围，导致必须选用na较低的探测物镜作为光片荧光显微成像系统的探测物镜，从而影响了最终荧光图像的二维分辨率，甚至低于传统共聚焦显微成像获得的图像的二维分辨率，例如光片荧光显微镜的横向分辨率为350-500纳米，而共聚焦显微镜的横向分辨率可达200纳米；(2
技术实现思路
1、本申请旨在提出一种新颖的超分辨光片荧光显微成像系统，从而能够克服上述列出的传统光片显微成像系统中的不足，实现超分辨显微成像，既可以高效提升所获取的荧光图像的二维分辨率、也可以高效提升所获取的荧光图像的三维分辨率。
2、根据本申请的一个方面，提供了一种超分辨光片荧光显微成像方法，包括：
3、利用可逆光开关荧光蛋白对待测生物样本进行处理；
4、令光片作为激活光面入射待测生物样本，以在其可逆光开关荧光蛋白中产生激活部分；
5、令经调制的条纹结构光作为激发光朝向所述激活部分所在的面入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上，以使得在所述光片所入射的平面上所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分发出荧光，其中，所述激活光与所述激发光具有不同的波长；
6、采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的二维荧光图像。
7、可选地，在考虑将使用线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，针对利用激活光片入射的可逆光开关荧光蛋白的每个待激活部分，分别先令激活光片入射且再令所述经调制的条纹结构光入射n·m次，n和m都是大于或等于3的整数，并且每次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向在所述光片所处的平面中观察彼此相差180/m度并且条纹相位相差2π/n。
8、可选地，在每次经调制的条纹结构光作为激发光入射所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上后，与该次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向相同但相位相差π的条纹结构光作为激发光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上。
9、可选地，在考虑将使用非线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，n和m至少是5。
10、可选地，所述光片通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格的抖动而形成。
11、可选地，以近红外波长的单贝塞尔光束产生光片作为激活光而以在所述可逆光开关荧光蛋白中引起双光子效应的方式入射生物样本。
12、可选地，在作为激活光的光片已经入射所述生物样本后并且在作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上之前，采用由具有激发光波长的光形成的用于减薄的光片在所述激活部分的两侧有部分重叠地照射，以减薄所述激活部分的厚度。
13、可选地，作为激活光的光片与生物样本之间的相对位置至少在与所述光片所处的平面垂直的方向上发生改变，从而通过作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上、激发荧光并采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的三维荧光图像堆栈。
14、可选地，光片与生物样本之间的相对位置发生改变是通过使得光片本身移动或者通过使得生物样本移动来实现的。
15、根据本申请的另一个方面，提供了一种超分辨光片荧光显微成像系统，包括：
16、光源模块；
17、激光选通和分光模块；
18、第一光片生成模块；
19、光片扫描模块；
20、激活物镜；
21、结构光生成与偏振调制模块；
22、探测物镜；
23、荧光检测模块；以及
24、样本置放移动模块，
25、所述第一光片生成模块、所述光片扫描模块和所述激活物镜组成第一光片激活光路，所述结构光生成与偏振调制模块、所述荧光检测模块和所述探测物镜组成结构光激发与探测光路，所述激光选通和分光模块配置成由所述光源模块发出的激光束选择性进入所述第一光片激活光路或所述结构光激发与探测光路；
26、所述第一光片激活光路配置成产生光片作为激活光入射经可逆光开关荧光蛋白处理的待测生物样本，以在可逆光开关荧光蛋白中产生激活部分；
27、所述结构光激发与探测光路配置成产生经调制的条纹结构光作为激发光入射到所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分上，以使得在所述光片所入射的平面上所述可逆光开关荧光蛋白的激活部分发出荧光，其中，所述激活光与所述激发光具有不同的波长；
28、所述结构光激发与探测光路还配置成采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的二维荧光图像。
29、可选地，所述第一光片生成模块包括第一振镜，所述光片通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格经由所述第一振镜的抖动而形成。
30、可选地，系统还包括：
31、能够独立于所述光源模块发出激光束的第二光片生成模块；
32、所述第二光片生成模块、所述第一光片生成模块的第一振镜、所述光片扫描模块和所述激活物镜组成第二光片激活光路，
33、所述第二光片生成模块包括：
34、独立于光本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种超分辨光片荧光显微成像方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在考虑将使用线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，针对利用激活光片入射的可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的每个待激活部分，分别先令激活光片入射且再令所述经调制的条纹结构光入射N·M次，N和M都是大于或等于3的整数，并且每次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向在所述光片所处的平面中观察彼此相差180/M度并且条纹相位相差2π/N。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在每次经调制的条纹结构光作为激发光入射所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上后，与该次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向相同但相位相差π的条纹结构光作为激发光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在考虑将使用非线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，N和M至少是5。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述光片通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格的抖动而形成。
6.根据权利要求5所
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在作为激活光的光片已经入射所述生物样本(1000)后并且在作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上之前，采用由具有激发光波长的光形成的用于减薄的光片在所述激活部分的两侧有部分重叠地照射，以减薄所述激活部分的厚度。
8.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于，作为激活光的光片与生物样本之间的相对位置至少在与所述光片所处的平面垂直的方向上发生改变，从而通过作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上、激发荧光并采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的三维荧光图像堆栈。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，光片与生物样本之间的相对位置发生改变是通过使得光片本身移动或者通过使得生物样本(1000)移动来实现的。
10.一种超分辨光片荧光显微成像系统，包括：
11.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，在考虑将使用线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，针对利用激活光片入射的可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的每个待激活部分，分别先令激活光片入射且再令所述经调制的条纹结构光入射N·M次，N和M都是大于或等于3的整数，并且每次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向在所述光片所处的平面中观察彼此相差180/M度并且条纹相位相差2π/N。
12.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，在每次经调制的条纹结构光作为激发光入射所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上后，与该次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向相同但相位相差π的条纹结构光作为激发光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上。
13.根据权利要求11或12所述的系统，其特征在于，在考虑将使用非线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，N和M至少是5。
14.根据权利要求10或11或12或13所述的系统，其特征在于，所述第一光片生成模块(300)包括第一振镜(Galvo1)，所述光片通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格经由所述第一振镜(Galvo1)的抖动而形成。
15.根据权利要求14所述的系统，其特征在于，还包括：
16.根据权利要求15所述的系统，其特征在于，在作为激活光的光片已经入射所述生物样本(1000)后并且在作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上之前，采用由具有激发光波长的光形成的用于减薄的光片在所述激活部分的两侧有部分重叠地照射，以减薄所述激活部分的厚度。
17.根据权利要求10至16任一所述的系统，其特征在于，作为激活光的光片与生物样本之间的相对位置至少沿着探测物镜(700)的光轴发生改变，从而通过作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)的激活部分上、激发荧光并采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的三维荧光图像堆栈。
18.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述光片扫描模块(400)配置成仅使得作为激活光的光片移位并使得探测物镜同步沿着其光轴移动或者仅使得所述样本置放移动模块(900)移动，从而至少沿着探测物镜(700)的光轴改变光片与生...
【技术特征摘要】
1.一种超分辨光片荧光显微成像方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在考虑将使用线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，针对利用激活光片入射的可逆光开关荧光蛋白(rsfps)的每个待激活部分，分别先令激活光片入射且再令所述经调制的条纹结构光入射n·m次，n和m都是大于或等于3的整数，并且每次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向在所述光片所处的平面中观察彼此相差180/m度并且条纹相位相差2π/n。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在每次经调制的条纹结构光作为激发光入射所述可逆光开关荧光蛋白(rsfps)的激活部分上后，与该次入射的经调制的条纹结构光的条纹方向相同但相位相差π的条纹结构光作为激发光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(rsfps)的激活部分上。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在考虑将使用非线性超分辨重建算法进行超分辨图像重建时，n和m至少是5。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述光片通过单贝塞尔光束或多光束干涉晶格的抖动而形成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以近红外波长的单贝塞尔光束产生光片作为激活光而以在所述可逆光开关荧光蛋白(rsfps)中引起双光子效应的方式入射生物样本。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在作为激活光的光片已经入射所述生物样本(1000)后并且在作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(rsfps)的激活部分上之前，采用由具有激发光波长的光形成的用于减薄的光片在所述激活部分的两侧有部分重叠地照射，以减薄所述激活部分的厚度。
8.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于，作为激活光的光片与生物样本之间的相对位置至少在与所述光片所处的平面垂直的方向上发生改变，从而通过作为激发光的经调制的条纹结构光入射到所述可逆光开关荧光蛋白(rsfps)的激活部分上、激发荧光并采集带有结构光条纹信息的荧光图像作为用于超分辨图像处理的三维荧光图像堆栈。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，光片与生物样本之间的相对位置发生改变是通过使得光片本身移动或者通过使得生物样本(1000)移动来实现的。
10.一种超分辨光片荧光显微成像系统，包括：
【专利技术属性】
技术研发人员：李栋，董学，杨晓雨，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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