【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及植物转基因，更具体涉及马铃薯u6启动子的克隆和应用。
技术介绍
1、 马铃薯（solanum tuberosum）是全球第四大粮食作物，仅次于水稻、玉米和小麦。马铃薯栽培种主要是四倍体（2n=4x=48），通过块茎进行营养繁殖，是自交作物，但又具有自交衰退和自交不亲和的特性。马铃薯主要以传统的杂交育种来进行品种选育，即利用配合力较好的亲本配制杂交组合，对所获得的实生种子后代进行性状鉴定，进而选育新品种。故此，马铃薯新品种的选育周期较长，选育性状有较强的随机性，较难兼顾产量、品质和抗逆性等重要性状。迫切需要高效的技术来对马铃薯进行遗传改良。
2、 在2013年初，crispr/cas9技术（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat -associated protein 9）被开发并成功应用于动物细胞的基因编辑（cong et al., 2013; ran et al., 2013）。由于其具有编辑效率高、操作简便和脱靶率低等优点，在2013年就已有多个用于植物基因编辑的crispr/cas9系统得到开发和应用（miaoet al., 2013; jiang et al., 2013; shan et al., 2013），随后植物crispr/cas9系统得到了快速发展和运用。虽然crispr/cas9技术已广泛用于作物功能基因和遗传改良研究，但大多数相关研究主要集中于二倍体作物。一些重要的粮食作物和经济作物的基因组为多
3、 在crispr/cas9系统中，u6 snrna（small nuclear rna）启动子是一类细胞核内的rna聚合酶iii型启动子，常被用于驱动sgrna在细胞核内表达。u6启动子具有一定的物种特异性，在基因编辑过程中，使用植物物种本身的内源u6启动子能够有更高的编辑效率。目前，能够用于马铃薯基因编辑的内源u6启动子研究较少，仍缺少适用的马铃薯u6启动子，这限制了马铃薯基因编辑技术的应用。因此，筛选和研究马铃薯中高活性的u6启动子对马铃薯的基因工程遗传改良有重要的推进作用。
4、为此，本专利技术的目的在于提供马铃薯u6启动子stu6 8-1，并进一步公开其克隆方法和应用。
5、 本专利技术提供的马铃薯u6启动子为stu6 8-1；stu6 8-1启动子的dna核苷酸序列如seq id no:2所示。stu6 8-1启动子来源于马铃薯第8染色体。
6、 本专利技术还提供了一种克隆上述马铃薯stu6 8-1启动子的克隆方法，包括以下步骤：
7、（1）以马铃薯栽培品种‘青薯9号’叶片基因组dna为模板，采用stu6 8-1的特异性引物进行pcr扩增，使用高保真酶phantar max在25 μl反应体系pcr扩增，pcr反应程序为：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环，然后72℃5min；将所得pcr产物经过琼脂糖切胶纯化；
8、（2）将纯化后的pcr产物克隆到peasyr-blunt克隆载体上，转入大肠杆菌dh5α中，并挑取单克隆提取质粒进行测序分析，获得511 bp stu6 8-1基因启动子片段（如seq idno:2所示）。
9、 stu6 8-1的特异性引物，具体如下：
10、stu6 8-1pf：aattgacgggtagacatca，
11、stu6 8-1pr：cagacatataggttaatgttttg。
12、 本专利技术还公开了用于构建马铃薯基因编辑载体的sgrna表达盒载体，即含有马铃薯u6启动子stu6 8-1。
13、 具体的，该马铃薯sgrna表达盒载体为重组质粒stu6 8-1-sgrna。
14、本专利技术还提供了一种用于马铃薯基因编辑载体的sgrna表达盒载体的构建方法，包括如下步骤：
15、（1）以seq id no:2所示的stu6 8-1基因启动子序列为模板，利用以下含同源臂的引物对stu6 8-1基因启动子进行pcr扩增：
16、stu6 8-1gf：gtggaatcggcagcaaaggaaattgacgggtagacatca；
17、stu6 8-1gr：tgttatcttcagaggtctctcagacatataggttaatgttttg；
18、对pcr产物进行纯化，获得含同源臂的stu6 8-1基因启动子片段；
19、（2）以pylsgrna-atu6-1质粒为模板，以引物sgrna-f和sgrna-r进行pcr，对pylsgrna-atu6-1质粒中的atu6-1基因启动子进行删除和质粒线性化处理，引物序列如下：
20、sgrna-f：agagacctctgaagataaca；
21、sgrna-r：tcctttgctgccgattccac；
22、使用高保真酶phantar max在25 μl反应体系中进行pcr扩增，pcr反应程序为：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃3：30s，30个循环，然后72℃5min；将所得pcr产物经过琼脂糖切胶纯化，获得线性化的pylsgrna质粒；
23、（3）用exnaserii重组酶将步骤（1）所述含同源臂的stu6 8-1基因启动子片段重组到步骤（2）所述线性化的pylsgrna质粒中，得到马铃薯基因编辑载体所用的sgrna表达盒载体stu6 8-1-sgrna。
24、 上述马铃薯u6启动子stu6 8-1在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。茄科植物包括烟草、马铃薯。马铃薯stu6 4-1启动子和stu6 8-1启动子具有转录活性，可驱动下游sgrna表达，并实现了马铃薯内源u6启动子驱动的本氏烟草和马铃薯基因的定向编辑，并且可对靶向基因进行单位点或多位点的基因编辑。
25、上述sgrna表达盒载体在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。茄科植物包括烟草、马铃薯。
26、本专利技术克隆了两个新的马铃薯u6启动子，并构建了马铃薯基因编辑所用的stu64-1-sgrna和stu6 8-1-sgrna表达盒载体，通过上述两个载体构建了本氏烟草nbpds和马铃薯stpds基因编辑载体。本氏烟草叶片瞬时转化和马铃薯茎段胚性愈伤稳定转化，验证了两个u6启动子的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.马铃薯U6启动子序列，其特征在于：所述的马铃薯U6启动子为StU6 8-1；StU6 8-1启动子的DNA核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.用于构建马铃薯基因编辑载体的sgRNA表达盒载体，其特征在于：含有权利要求1所述的马铃薯U6启动子StU6 8-1。
3.如权利要求1所述的马铃薯U6启动子的克隆方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：StU6 8-1的特异性引物如下：
5.如权利要求2所述的sgRNA表达盒载体，其特征在于：该sgRNA表达盒载体为重组质粒StU6 8-1-sgRNA，其构建方法包括如下步骤：
6.如权利要求1所述的马铃薯U6启动子StU6 8-1在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。
7.如权利要求2或5所述的sgRNA表达盒载体在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：茄科植物包括烟草、马铃薯。
【技术特征摘要】
1.马铃薯u6启动子序列，其特征在于：所述的马铃薯u6启动子为stu6 8-1；stu6 8-1启动子的dna核苷酸序列如seq id no:2所示。
2.用于构建马铃薯基因编辑载体的sgrna表达盒载体，其特征在于：含有权利要求1所述的马铃薯u6启动子stu6 8-1。
3.如权利要求1所述的马铃薯u6启动子的克隆方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：stu6 8-1的特异性引物如下：
...【专利技术属性】
技术研发人员：郭华春，李有涵，王琼，马艳颖，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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