【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于类器官制备，具体涉及一种人血管化成体肺类器官及其构建方法。
技术介绍
1、肺疾病(如哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等)在全球范围内具有较高的发病率和致死率。肺部肿瘤和空气传播感染又增加了肺部疾病相关发病率和死亡率的负担，covid-19大流行表明病毒性肺部疾病对全球人口的潜在影响。离体原始组织的研究不能提供动态信息，而肺的相对不可及及其不断的运动妨碍了在临床前模型中广泛使用。
2、类器官是一种能够模拟人体特定器官和功能的3d模型，它们是由能分化成各种特殊类型细胞的干细胞产生的。2d细胞系缺乏细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用，不能完全模拟体内环境，类器官更好地反映真实生理条件。利用肺类器官可以模拟各种肺部疾病，如囊性纤维化、肺纤维化、哮喘和肺癌等。肺类器官也在药物筛选、病毒感染、毒理学和环境研究以及再生医学方面有着非凡的能力。
3、充分的血管化对于维持组织和器官的健康至关重要。现有方法分离培养的肺类器官往往难以形成健全的血管网络，这会限制其长期生存和功能。虽然，目前已有一些研究人员开发出多种肺血管化方案，但是其仍存在不同的问题。例如，2007年tan等利用人肺上皮细胞、人肺内皮细胞及人肺间质细胞通过气液界面的培养实现血管化人气道类器官；2021年shravanthi等利用人脐静脉内皮细胞(huvec)及人非小细胞肺癌细胞(a549)接种到384孔的iflow板中实现血管化肺。但是这些都用的是人血管内皮细胞系，并不包含血管重要的组成成分——周细胞，也不是3d培养的，并不能很好地模拟肺的复杂性
4、由此可见，开发出既具有完全功能，又操作简单的血管化肺类器官是目前肺类器官临床应用的关键问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的肺类器官血管化困难，提供一种操作较为简单、规范化的血管人肺类器官的构建方法。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案为：提供一种血管化人成体肺类器官的构建方法。该方法包括以下步骤：
3、a、取人肺癌癌旁组织，清洗剪切后，依次采用肺组织消化液、胰酶和红细胞裂解液裂解后，采用dmem/f12进行重悬，离心，得到混合细胞系；
4、b、将混合细胞系与基质胶混合，种植到孔板中，加入人肺类器官培养基，置于37℃孵箱培养，待类器官生长到中间开始变黑时进行传代，得到人肺类器官；
5、c、取人成纤维细胞来源的诱导多能干细胞fipsc，消化成单细胞悬液，采用含30-100μmy-27632的mtesr培养基培养22-26h，直到形成具有光滑边界的细胞聚集体，再采用中胚层诱导培养基培养3-4天，形成中胚层，再加入血管谱系诱导培养基培养2-3天，形成血管祖细胞球；
6、d、将人肺类器官和血管祖细胞球按照比例3-4:1进行融合，采用基质胶混匀后进行种植培养，培养3-7天，得到血管化的人成体肺类器官。
7、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤a所述的清洗采用含有1％青霉素或链霉素的pbs溶液清洗，每次清洗2-3分钟，清洗15-18次。
8、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤a所述剪切后的组织块大小为2-4mm2。
9、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤a所述的裂解的具体步骤为：先采用肺组织消化液裂解10-30min，过滤，将滤液离心，收集沉淀；滤渣再采用胰酶裂解10-30min后终止，过滤，将滤液离心，收集第二次沉淀，将两次收集的沉淀合并，加入红细胞裂解液继续裂解，离心，直至沉淀中没有红细胞。
10、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤a所述肺组织消化液是由dmem/f12含有0.5-1mg/ml的胶原酶ⅰ和0.5-1mg/ml的胶原酶ⅳ配制而成。
11、进一步的，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤a所述的过滤采用40-100μm滤网过滤；所述的离心条件为500g离心3-5min；所述的裂解为置于37℃摇床中，每4-10分钟摇晃一次。
12、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤a所述混合细胞系的组成包括上皮细胞、间质细胞、免疫细胞和内皮细胞。
13、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤b所述的细胞系与基质胶的加入比例为：每1000-3000个细胞加入25-45μl基质胶。
14、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤b所述的基质胶为r&dsystems公司的型号为3533-010-02的产品。
15、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤b所述人肺类器官培养基的组成包括：每50ml的dmem/f12培养基中含2％b27减维生素a的补充剂(50x)，1％n2(100x)，2mm谷氨酰胺补充剂(glutamax)，1％青霉素-链霉素(penicillin–streptomycin)，1.25m乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine)，50-100ng/ml表皮生长因子(egf)，3-10μm wnt信号转导的激动剂(chir99021)，50-100ng/ml noggin，50-100ng/ml成纤维细胞生长因子(fgf7)，10-20μm tgf-βri激酶抑制剂vi(sb431542)。
16、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤b所述的传代具体操作步骤为：将类器官弃去培养基，加入tryple混匀，放入37℃孵箱孵育5-10min后，500g离心3-5min；弃上清，用dmem/f12重悬类器官沉淀，500g离心5min；弃上清，基质胶重悬类器官，按照1传3的比例进行传代后，在37℃孵箱中凝固10-30min，加入200-500μl人肺类器官培养基培养。
17、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤b所述的单细胞悬液浓度为3.0-5.0×105个细胞/ml。
18、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤b所述的中胚层诱导培养基的组成包括：每50ml基础培养基n2b27培养基中，再加入chir99021 10-50μm，bmp4 10-50ng/ml。
19、进一步的，所述的n2b27培养基的组成包括：每50ml中含有dmem/f12 25ml，neurobasal培养基25ml，b27 1.0-2.0％，n2 0.5-1.0％，glutamax 1-5mm，β-巯基乙醇0.1-0.5mm，penicillin–streptomycin 1-5％。
20、其中，上述血管化人成体肺类器官的构建方法中，步骤b所述的血管谱系诱导培养基组成包括：每50ml基础培养基n2b27培养基中，再加入vegf-a50-200ng/ml，forskolin 1-5μm。
21、其中，上述血管人成体肺类器官的构建方法中，步骤d中所述的基质胶为30μl本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤a所述的裂解的具体步骤为：先采用肺组织消化液裂解10-30min，过滤，将滤液离心，收集沉淀；滤渣再采用胰酶裂解10-30min后终止，过滤，将滤液离心，收集第二次沉淀，将两次收集的沉淀合并，加入红细胞裂解液继续裂解，离心，直至沉淀中没有红细胞。
3.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：满足下述至少一项，
4.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤b所述的细胞系与基质胶的加入比例为：每1000-3000个细胞加入25-45μl基质胶。
5.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤b所述人肺类器官培养基的组成包括：每50ml的DMEM/F12培养基中含2％B27减维生素A的补充剂，1％N2，2mM谷氨酰胺补充剂，1％青霉素-链霉素，1.25M乙酰半胱氨酸，50-100ng/ml表皮生长因子，3-10μM WNT信号转
6.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤b所述的传代具体操作步骤为：将类器官弃去培养基，加入TrypLE混匀，放入37℃孵箱孵育5-10min后，500g离心3-5min；弃上清，用DMEM/F12重悬类器官沉淀，500g离心5min；弃上清，基质胶重悬类器官，按照1传3的比例进行传代后，在37℃孵箱中凝固10-30min，加入200-500μl人肺类器官培养基培养。
7.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：满足下述至少一项，
8.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤d中所述的培养的具体操作步骤为：37℃5％CO2孵箱中孵育10-30min后，按照400μl培养体系，人肺类器官和血管祖类器官的培养体系1:1加入培养基培养3-7天。
9.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤d中人肺类器官的数量为1～20个；优选为12个；血管祖类器官的数量为1～5个；优选为4个。
10.权利要求1-9任一项所述的方法构建得到的血管化人成体肺类器官。
...【技术特征摘要】
1.血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤a所述的裂解的具体步骤为：先采用肺组织消化液裂解10-30min，过滤，将滤液离心，收集沉淀；滤渣再采用胰酶裂解10-30min后终止，过滤，将滤液离心，收集第二次沉淀，将两次收集的沉淀合并，加入红细胞裂解液继续裂解，离心，直至沉淀中没有红细胞。
3.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：满足下述至少一项，
4.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤b所述的细胞系与基质胶的加入比例为：每1000-3000个细胞加入25-45μl基质胶。
5.根据权利要求1所述的血管化人成体肺类器官的构建方法，其特征在于：步骤b所述人肺类器官培养基的组成包括：每50ml的dmem/f12培养基中含2％b27减维生素a的补充剂，1％n2，2mm谷氨酰胺补充剂，1％青霉素-链霉素，1.25m乙酰半胱氨酸，50-100ng/ml表皮生长因子，3-10μm wnt信号转导的激动剂，50-100ng/ml noggin，50-100ng/ml成纤维细胞生长...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓洪新，冀艳红，陈娜，沈兰琳，任玉霜，代磊，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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