【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及蛋白质工程，具体涉及一种重组金属硫蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、金属硫蛋白(metallothionein，mt)是一类普遍存在于生物体内的富含半胱氨酸的低分子量(6-7kd)的多功能诱导性蛋白。自1957年美国学者mackay等首次从马肾中发现并分离出mt以来，科研工作者们陆续从动物、植物和微生物中都分离得到了mt，且在不同物种的组织器官中分离得到的mt在结构和数量上有些许不同，金属硫蛋白在进化上具有高度的保守性。根据金属离子含量和氨基酸组成的不同，可分为mt-i、mt-ii、mt-iii及mt-iv四种亚型。mt参与体内各种重要生理活动，如重金属解毒、清除自由基、调节体内微量元素浓度，并且在抗肿瘤、抗凋亡、激素调节和细胞代谢及增殖分化过程中都扮演了重要角色。
2、尽管mt的需求量很大，然而目前的工业化生产技术仍然没有得到突破。mt的动物源性提取，依旧占据原料来源的主要市场。然而，动物保护和动物疫病的传播(如疯牛病、动物病毒病等)，使得各国都很谨慎使用并控制进口。在非控制饲养来源的动物肝肾中提取mt，不仅产量低，而存在有害重金属携带的可能。
3、关于mt的生物发酵生产方面，国内外曾报道用枯草杆菌、链球菌、酵母菌等菌种采取高重金属胁迫适应筛选菌株方法生产，上世纪也曾报道基因工程重组载体导入宿主大肠杆菌、酵母菌诱导发酵生产，但效果均不尽人意。主要是mt产量过低或重金属污染而未能投入工业化的发酵提取。近年来，有报道gst或his融合蛋白载体在大肠杆菌表达mt，但标签对mt与金
4、弹性蛋白(eln，elastin)是生皮组织中弹性纤维(elastic fibers)的主要成分，主要存在于韧带和脉管壁。弹性纤维与胶原纤维共同赋予组织弹性和抗张能力。国内有研究学者发现将目的蛋白与弹性蛋白融合后，目的蛋白成功以可溶形式表达且具有生物活性，说明elp可提高目的蛋白可溶性。elp蛋白单独或与外源基因在n端或c端形成融合蛋白表达时具有相转变特性，即达到一定温度时elp蛋白或elp融合蛋白能发生从溶液到凝聚态的可逆转变，利用这一特性，采用离心的方式就能分离重组蛋白。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种重组金属硫蛋白高效制备工艺及应用。该制备工艺简单便捷，在大大降低了制备成本的同时，解决了制备产量低的问题，易于实现工业化生产。获得的emt蛋白，表现出良好的生物相容性和生物活性，能有效抗氧化、促进细胞黏附及迁移，具有促进修复的潜力。
2、具体而言，本专利技术的重组金属硫融合蛋白的技术方案如下：
3、一种重组金属硫蛋白，采用人源性金属硫蛋白为金属硫蛋白的来源，融合类弹性蛋白得到；所述类弹性蛋白包括重复氨基酸序列vpgvg，重复数量为10-60，融合形式为a-b、b-a，其中a为金属硫蛋白，b为弹性蛋白。
4、优选地，所述人源性金属硫蛋白的氨基酸序列分别如seq id no.1-4所示。
5、优选地，所述金属硫蛋白与人源性金属硫蛋白的氨基酸序列同源性≥90％。
6、本专利技术还公开了一种如上所述的重组金属硫蛋白的制备方法，构建含有融合蛋白目的基因的表达载体，导入大肠杆菌宿主细胞中表达；然后进行纯化，获得重组金属硫蛋白。
7、作为本专利技术的优选方案，所述纯化的方法选自盐析法、层析法和膜分离法中的一种或两种以上的组合。
8、作为本专利技术的优选方案，所述纯化方法依序包括以下步骤：将表达菌体通过破碎、盐析沉淀处理、阴离子交换层析、浓缩及缓冲液置换。
9、作为本专利技术的优选方案，所述盐析沉淀处理的工艺为：将表达菌体破碎后的细胞破碎上清液置于0.2～1m硫酸铵在0～37℃的条件下处理2～12h，离心收集沉淀后进行复溶，复溶在0～37℃的条件下处理2～12h，盐析法处理1～3次；
10、所述阴离子交换层析的流动相ph为7.0～9.0，采用盐离子浓度增加的方式洗脱目的蛋白。
11、作为本专利技术的优选方案，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
12、本专利技术还公开了一种如上所述的重组金属硫蛋白在制备抗氧化和修复作用产品上的应用。
13、作为本专利技术的优选方案，所述产品包括化妆品、保健品以及食品中的至少一种。
14、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
15、(1)本专利技术所制备的重组金属硫蛋白，与动植物来源的金属硫蛋白相比，具有分子量均一、易获取、纯度高等优点。
16、(2)本专利技术构建的重组金属硫蛋白可在大肠杆菌体系实现可溶性表达，表达量高且易于纯化。
17、(3)本专利技术制备的重组金属硫蛋白，即具备原有的金属硫蛋白抗氧化特性，同时具备类弹性蛋白良好的生物相容性、促进细胞黏附及迁移特性，可广泛应用于化妆品、保健品、食品等领域。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种重组金属硫蛋白，其特征在于，采用人源性金属硫蛋白为金属硫蛋白的来源，融合类弹性蛋白得到；所述类弹性蛋白包括重复氨基酸序列VPGVG，重复数量为10-60，融合形式为A-B、B-A，其中A为金属硫蛋白，B为弹性蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组金属硫蛋白，其特征在于，所述人源性金属硫蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
3.根据权利要求1所述的一种重组金属硫蛋白，其特征在于，所述金属硫蛋白与人源性金属硫蛋白的氨基酸序列同源性≥90％。
4.一种如权利要求1所述的重组金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，构建含有融合蛋白目的基因的表达载体，导入大肠杆菌宿主细胞中表达；然后进行纯化，获得重组金属硫蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种重组金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法选自盐析法、层析法和膜分离法中的一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求4所述的一种重组金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化方法依序包括以下步骤：将表达菌体通过破碎、盐析沉淀处理、阴离子交换层析、浓缩及缓冲液置换。
7.根据权利要求6所述的一种重组金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述盐析沉淀处理的工艺为：将表达菌体破碎后的细胞破碎上清液置于0.2～1M硫酸铵在0～37℃的条件下处理2～12h，离心收集沉淀后进行复溶，复溶在0～37℃的条件下处理2～12h，盐析法处理1～3次；
8.根据权利要求4所述的一种重组金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
9.一种如权利要求1-3任一所述的重组金属硫蛋白或权利要求4-8任一所述的制备方法制得的重组金属硫蛋白在制备抗氧化和修复作用产品上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括化妆品、保健品以及食品中的至少一种。
...【技术特征摘要】
1.一种重组金属硫蛋白，其特征在于，采用人源性金属硫蛋白为金属硫蛋白的来源，融合类弹性蛋白得到；所述类弹性蛋白包括重复氨基酸序列vpgvg，重复数量为10-60，融合形式为a-b、b-a，其中a为金属硫蛋白，b为弹性蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组金属硫蛋白，其特征在于，所述人源性金属硫蛋白的氨基酸序列分别如seq id no.1-4所示。
3.根据权利要求1所述的一种重组金属硫蛋白，其特征在于，所述金属硫蛋白与人源性金属硫蛋白的氨基酸序列同源性≥90％。
4.一种如权利要求1所述的重组金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，构建含有融合蛋白目的基因的表达载体，导入大肠杆菌宿主细胞中表达；然后进行纯化，获得重组金属硫蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种重组金属硫蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法选自盐析法、层析法和膜分离法中的一种或两种以上的组合。
...【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，叶贤龙，刘龙英，于伟，汪婷婷，徐思梦，
申请(专利权)人：赣江中药创新中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。