【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地，本专利技术涉及一种抗体fab片段的二聚体、其制备方法及应用。
技术介绍
1、抗体由b细胞接受抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生，具有与抗原特异性结合的功能。抗体结构由决定抗原结合能力的fab区和诱导抗体依赖性细胞毒作用(adcc)、补体依赖性细胞毒作用(cdc)的fc区组成，但fc片段容易引起非特异性的结合，对于临床诊断和治疗存在不利的影响。相比于完整抗体，无fc片段的小分子抗体药物具有以下优势：特异性强；分子量较小，更容易进入肿瘤组织内部；可在大肠杆菌中表达，成本低，周期短；免疫原性弱等。常见的单价小分子抗体如抗原结合片段fab、单链可变区片段scfv、可变区片段fv、单域抗体等，但由于单价小分子抗体存在着分子量低，极易被清除，半衰期较短，且亲和力较低的缺点，在实际应用中有必要设计多价小分子抗体，如双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)等。多价抗体可以结合多个抗原表位，相比于单价抗体，有更高的亲和力和较慢的解离速度，并且有些抗体的多价结合还可引起受体交联，激发细胞内信号转导，激活细胞或者诱导细胞凋亡等生物学效应。多价抗体的形成可通过交联方式连接，如fab段可通过基因工程linker连接成二聚体、三聚体等，也可通过自聚化结构域而形成，最终增加抗体分子大小，提高抗体药物在体内的半衰期。随着小分子抗体药物深入研究，其在临床应用中愈加广泛，如连接毒素药物可用于肿瘤的治疗，另外在抗感染治疗、器官移植、变态反应性疾病等方面，小分子抗体药物也显示了较好的应用前景，因此将单价小分子抗体改建为多价抗
2、现有技术中对抗体fab片段的改构策略为引入(cpp)3序列，但利用该方法获得的二聚化抗体比例低，无法达到大规模生产的要求。因此，急需寻找到一种新的抗体fab片段的二聚体来解决上述问题。
技术实现思路
1、解决的技术问题：
2、本专利技术的一个方面，是针对现有技术中抗体fab片段二聚化方法的二聚体产率低，对靶细胞的亲和力弱的缺点，提供了一种抗体fab片段的二聚体、其制备方法及应用。
3、具体地，本公开中的技术方案通过在抗体fab段的ch1的c末端引入氨基酸序列(cp)n，其半胱氨酸氧化成二硫键，从而促使fab片段二聚化，最终形成同源二价抗体分子。
4、本专利技术提供的技术方案：
5、一种抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，
6、其中，所述n＝1、2、3、4或5。
7、作为优选，在本公开的某些实施方式中，上述n＝1、2或3。更优选地，在本公开的一个实施方式中，上述n＝3。在本公开中，所述氨基酸序列(cp)n为包含n个cp重复单元的氨基酸序列，即，例如，cpcp、cpcpcp、cpcpcpcp、cpcpcpcpcp，在每个cp重复单元之间也可以插入至少一个与二聚化效果无关的氨基酸残基。在本公开的某些实施方式中，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n。在本公开的另一些实施方式中，所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地通过连接体(linker1)与所述氨基酸序列(cp)n连接，其目的和手段可以是现有技术中已知的，例如，增加富含甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的柔性肽连接体以增加所述二聚体的柔性，等。
8、在本公开的某些实施方式中，所述二聚体可以为同源二聚体，也可以为异源二聚体。所述同源二聚体或异源二聚体可以在单体fab片段形成后，自发地或人工地组装成二聚体。可以利用现有技术中合适的方法实现上述组装，示例性的例子如，将包含不同单体fab片段基因序列的载体在同一表达系统中进行表达，所获得的表达产物中包含有由不同单体fab片段组装形成的异源二聚体。
9、在本公开中，由所述单体fab片段形成的二聚体之间可以通过任意合适的共价键或非共价键连接。作为优选，在本公开的某些实施方式中，所述单体fab片段之间通过二硫键连接。
10、在本专利技术的某些实施方式中，示例性的技术方案，例如：
11、一种抗cd19抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，
12、其中，所述n＝1、2、3、4或5；优选地，所述n＝3。
13、再例如：
14、一种抗cd20抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，
15、其中，所述n＝1、2、3、4或5；优选地，所述n＝3。
16、再例如：
17、一种抗bcma抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，
18、其中，所述n＝1、2、3、4或5；优选地，所述n＝3。
19、在本公开中，通过上述技术方案能够实现抗体fab片段的二聚化。为了更好地发挥fab段二聚体的某些功效，在本公开的某些实施方式中，所述氨基酸序列(cp)n的末位脯氨酸残基还可以直接地连接效应分子，或所述氨基酸序列(cp)n的末位脯氨酸残基还可以间接地经过至少一个连接体(linker2)连接所述效应分子。经过连接体(linker2)连接的目的和手段可以是现有技术中已知的，例如，增加富含甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的柔性肽连接体以增加所述二聚体的柔性，等。
20、在本公开的某些实施方式中，所述效应分子可以为抗癌剂、抗炎剂、抗自身免疫性疾病剂、抗感染剂、毒素、放射治疗剂、核苷酸或细胞因子。作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述效应分子为tnf家族成员或力达霉素中的辅基蛋白ldp。在本公开中，上述效应分子可以为蛋白质、核酸或小分子化合物，其与所述二聚体连接的手段可以为现有技术中合适的方法。所述效应分子示例性的例子如，trail，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体trail也称cd253或tnf10，是tnf超家族的成员。trail是一种ii型糖蛋白，由281个氨基酸组成，其中c端的241个氨基酸在胞外，胞外部分降解后形成有功能性的可溶性的tra本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗体Fab片段的二聚体，所述抗体Fab片段包括VL、VH、CL和CH1部分，所述二聚体包括两个单体Fab片段，其特征在于，所述单体Fab片段的CH1部分的C末端直接地连接氨基酸序列(CP)n，或所述单体Fab片段的CH1部分的C末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(CP)n，
2.根据权利要求1所述的二聚体，其特征在于，所述n＝1、2或3，优选为n＝3。
3.根据权利要求1或2所述的二聚体，其特征在于，所述二聚体为同源二聚体或异源二聚体。
4.根据权利要求1或2所述的二聚体，其特征在于，所述单体Fab片段之间通过二硫键连接。
5.根据权利要求1或2所述的二聚体，其特征在于，所述氨基酸序列(CP)n的末位脯氨酸残基还直接地连接效应分子，或所述氨基酸序列(CP)n的末位脯氨酸残基还间接地经过至少一个连接体连接所述效应分子。
6.根据权利要求5所述的二聚体，其特征在于，所述效应分子为抗癌剂、抗炎剂、抗自身免疫性疾病剂、抗感染剂、毒素、放射治疗剂、核苷酸或细胞因子；
7.根据权利要求1或2所述的二聚
8.根据权利要求7所述的二聚体，其特征在于，所述蛋白质片段为特异性结合靶蛋白的配体、受体、scFv、Fv或dAb，或所述配体、受体、scFv、Fv、dAb的多价体。
9.一种抗体Fab片段二聚化载体的构建方法，所述Fab片段包括设置于所述片段C末端的重链恒定区CH1部分，所述二聚体包括两个单体Fab片段，其特征在于，在载体中设置编码所述单体Fab片段的核苷酸序列，在所述核苷酸序列的3’末端直接或间接地设置编码(CP)n的核苷酸序列；
10.一种抗体Fab片段二聚化的方法，其特征在于，包括：
11.如权利要求1～8任意一项所述的二聚体在制备治疗肿瘤、炎症、自身免疫性疾病或感染的药物中的用途。
12.如权利要求1～8任意一项所述的二聚体在制备抗体药物缀合物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，其特征在于，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，
2.根据权利要求1所述的二聚体，其特征在于，所述n＝1、2或3，优选为n＝3。
3.根据权利要求1或2所述的二聚体，其特征在于，所述二聚体为同源二聚体或异源二聚体。
4.根据权利要求1或2所述的二聚体，其特征在于，所述单体fab片段之间通过二硫键连接。
5.根据权利要求1或2所述的二聚体，其特征在于，所述氨基酸序列(cp)n的末位脯氨酸残基还直接地连接效应分子，或所述氨基酸序列(cp)n的末位脯氨酸残基还间接地经过至少一个连接体连接所述效应分子。
6.根据权利要求5所述的二聚体，其特征在于，所述效应分子为抗癌剂、抗炎剂、抗自身免疫性疾病剂、抗感染剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊冬生，卢杨，范冬梅，张砚君，雷晓敏，袁向飞，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：
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