一种表达FASLG的通用型细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达FASLG的通用型细胞及其制备方法与应用。通过在细胞中失活主要组织相容性复合体MHC‑I和II类基因后，过表达FASLG蛋白，获得的人多能干细胞或人类细胞系或人诱导多能干细胞可在逃逸T细胞攻击的基础上，进一步逃逸NK细胞的杀伤，其效果甚至优于已经报道的明星靶点CD47和CD24。同时这些低免疫原性的多能干细胞保留了其干性和分化能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程与干细胞技术交叉领域，具体涉及一种表达faslg的通用型细胞及其制备方法。

技术介绍

1、通过细胞的体外培养或干细胞的诱导分化，能够在体外大量的再生健康的功能细胞，能够通过异体功能细胞移植治疗疾病，但是，免疫不相容和移植细胞遭受的免疫排斥仍然是其临床应用的关键障碍。干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(totipotent stem cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells，pscs)和成体干细胞(adult stem cell)。人类胚胎干细胞(hesc)和诱导多能干细胞(ipsc)具有无限增殖、自我更新和分化到各种类型细胞的潜力，在治疗癌症、神经相关、心血管等疾病具有重要应用前景。

2、移植自体细胞治疗可以回避免疫排斥问题，但是从病人身上制造自体细胞成本高昂且制备流程周期长(khera et al.，2013)，并且个体来源的细胞产品的质量和有效性不确定。有数据表明病人体内的细胞与正常人的存在差异，治疗本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种通用型细胞，其特征在于，相对于野生型细胞，包含：

2.根据权利要求1所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞包括MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达降低或不表达。

3.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括修饰以增加以下一种或多种多肽的表达：DUX4，CD27，CD35，CD200，HLA-C，PD-L1，CD47，CD24，CD26，CCL21，Mfge8和SerpinB9。

4.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞中使用基因编辑工具靶向编码MHC-I的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，...

【技术特征摘要】

1.一种通用型细胞，其特征在于，相对于野生型细胞，包含：

2.根据权利要求1所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞包括mhc-i和mhc-ii人类白细胞抗原的表达降低或不表达。

3.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括修饰以增加以下一种或多种多肽的表达：dux4，cd27，cd35，cd200，hla-c，pd-l1，cd47，cd24，cd26，ccl21，mfge8和serpinb9。

4.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞中使用基因编辑工具靶向编码mhc-i的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，或编码mhc-ii的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，来实现mhc-i和/或mhc-ii基因的表达降低或不表达；

5.根据权利要求4所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括通过选择性灭活ciita基因的稀有切割核酸内切酶靶向ciita基因的遗传修饰。

6.根据权利要求1-5任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞还包括通过选择性灭活b2m基因的稀有切割核酸内切酶靶向b2m基因的遗传修饰。

7.根据权利要求5或6所述的通用型细胞，其特征在于，所述稀有切割核酸内切酶选自cas蛋白，tale-核酸酶，锌指核酸酶，大核酸酶和归巢核酸酶。

8.根据权利要求7所述的通用型细胞，其特征在于，其中通过稀有切割内切核酸酶靶向ciita基因或b2m基因的遗传修饰包括cas蛋白或编码cas蛋白的多核苷酸，和至少一个用于特异性靶向ciita基因或b2m基因的导向核糖核酸序列。

9.根据权利要求8所述的通用型细胞，其特征在于，使用crispr/cas9系统分别对b2m和ciita外显子区段进行两端直接敲除，其中，针对b2m基因的导向核糖核酸序列grna的靶序列为seq id no:2和3，针对ciita基因的导向核糖核酸序列grna的靶序列为seq id no:4和5。

10.根据权利要求1或2所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞中通过引入针对编码mhc-i的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，或编码mhc-ii的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，来实现mhc-i和/或mhc-ii基因的表达降低或不表达，其中所述基因表达修饰分子包括选自sirna，shrna，microrna，反义rna和另一种rna介导的抑制分子中的一种。

11.根据权利要求1-10任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述faslg的氨基酸序列与如seq id no:1所示的序列具有70％以上的同源性，例如80％以上的同源性，再例如90％以上、95％以上、98％以上的同源性；

12.根据权利要求1-11任一项所述的通用型细胞，其特征在于，所述细胞是胚胎干细胞或多能干细胞或诱导型多能干细胞；优选为低免疫原性干细胞；进一步优选为人类干细胞或人类体细胞；更进一步优选地，所述细胞是人诱导多能干细胞或人多能干细胞。

13.一种权利要求1-12任一项所述的通用型细胞的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

14.根据权利要求13所述的通用型细胞的制备方法，其特征在于，所述mhc-i的转录调节因子选自：b2m、tap1、tap2、tap相关糖蛋白(tapasin)或nlrc5中的一个或多个；所述mhc-ii的转录调节因子选自：ciita、rfxank、rfx5、rfxap中的一个或多个；优选地，所述转录调节因子选自b2m和ciita。

15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，步骤1)或2)所述的敲除为通过选择性灭活ciita基因或b2m基因的稀有切割核酸内切酶靶向ciita基因或b2m基因的遗传修饰；

16.根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，步骤1)或2)所述的敲除为通过引入针对编码mhc-i的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，或编码mhc-ii的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因的基因表达修饰分子，来实现mhc-i和/或mhc-ii基因的表达降低或不表达，其中所述基因表达修饰分子包括选自sirna，shrna，microrna，反义rna和另一种rna介导的抑制分子中的一种。

17.根据权利要求13-16任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)采用表达载体将编码faslg蛋白的核酸序列引入细胞中；

18.根据权利要求13-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)将编码faslg蛋白的核酸序列导入所述干细胞的选定位点；优选地，所述干细胞的选定位点是安全港基因位点。

19.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：士泽生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：