【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，特别是基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法。
技术介绍
1、目前，胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，是结缔组织的主要组成成分，三型胶原蛋白是一种间质胶原，由3条α1三链组成，它是皮肤、血管等组织的主要纤维蛋白成分之一，三型胶原蛋白通常与一型胶原蛋白共生，作为一种伴生胶原蛋白，三型胶原蛋白在哺乳动物体内多以富有弹性的薄纤维层的形式与一型胶原形成纤维组织，三型胶原蛋白在人体创伤愈合、组织修复中发挥重要作用，在皮肤修复敷料中有良好的应用效果，三型胶原蛋白呈现出独特的三螺旋结构，三螺旋结构是三型胶原蛋白具有良好生物功能的关键因素，因此，从动物组织中提取三型胶原蛋白的关键，是在保证其纯度的前提下，在提取过程中保持三型胶原蛋白的结构完整性，防止其发生变性，同时，作为医用材料的三型胶原蛋白，对于纯度和安全性均有严格的要求，对胶原蛋白中含有的内毒素等成分含量也设置了严格的行业标准，因此，需要一种创新的方法来获取高活性低毒性的三型胶原蛋白，基因编辑技术，特别是cpf1编辑技术，可以用于有针对性地修改生物体的基因组，通过将crispr-cas9技术应用于植物细胞，可以实现对蛋白质基因的编辑，从而创造出符合需求的三型胶原蛋白。
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，
2、鉴于上述和/或现有的基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法中存在的问题，提出了本专利技术。
3、因此，本专利技术所要解决的问题在于如何提供一种基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
5、本专利技术实施例提供了一种基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其包括，设计单导rna序列；根据rna序列构建cpf1质粒；将制备好的质粒送入植物细胞；筛选编辑后的植物细胞并验证胶原蛋白表达；对三型胶原蛋白功能分析和毒性评估并改进优化。
6、作为本专利技术所述基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述设计单导rna序列具体包括，确定目标三型胶原蛋白编码基因的dna序列，选择一个位于目标基因的关键区域的20-23个碱基对长的序列，以作为单导rna的目标序列，这个序列与所需的编辑目标相匹配，利用e-crisp识别合适的目标序列，并生成相应的单导rna序列。
7、作为本专利技术所述基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述根据rna序列构建cpf1质粒具体包括，利用基因合成服务将cpf1蛋白基因进行合成，将cpf1基因插入适用的表达载体中，包括启动子、终止子和选择性抗生素抗性基因，以便在植物细胞中实现表达。
8、作为本专利技术所述基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述将制备好的质粒送入植物细胞具体包括，通过电击法，制备含有cpf1基因和相应单导rna的质粒，转化目标植物细胞，通过农杆菌介导法，将质粒导入植物细胞中。
9、作为本专利技术所述基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述筛选编辑后的植物细胞并验证胶原蛋白表达具体包括，从转化过的植物组织中，分离并培养出单个细胞，或者利用再生培养条件，将转化细胞培养为植株，在培养基中添加抗生素抗性基因，成功整合了质粒的编辑细胞能存活和繁殖，定期观察细胞的生长情况，筛选出在选择性抗生素存在下生长正常的细胞株，从候选编辑细胞中提取总dna，使用pcr、限制性内切酶分析或测序等方法验证编辑的发生，设计特定的引物来扩增目标区域，通过检测片段大小或限制性酶切位点的变化来判断编辑的成功性；进行目标区域的测序，以确认编辑类型和编辑效率，从编辑后的植物细胞中收集细胞样本，使用rna提取试剂盒和蛋白提取试剂盒来提取总rna或总蛋白；使用逆转录酶将rna转录成cdna，然后使用引物扩增目标胶原蛋白基因的cdna，比较编辑细胞和野生型细胞的pcr产物，检查胶原蛋白的表达情况。
10、作为本专利技术所述基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法的一种优选方案，其中：所述对三型胶原蛋白功能分析和毒性评估并改进优化具体包括，使用标准的胶原纤维形成实验，通过观察纤维的显微镜图像来评估检测编辑后的三型胶原蛋白，确定具有正常的纤维形成能力；根据三型胶原蛋白的功能，进行相关的生物活性检测，例如，若编辑后的胶原蛋白用于创伤愈合，则进行创伤愈合相关的生物活性测试并显示创伤愈合效果显著，达到高活性标准；使用mtt试剂法，评估编辑后的胶原蛋白对细胞的毒性，在小鼠模型中进行毒性评估，通过皮下注射或其他途径将编辑后的胶原蛋白注入小鼠体内，监测其对动物的影响，结果显示小鼠的活动均正常，其与毒性相关检测均显示低毒素，在预测范围内；尝试在不同浓度下对编辑后的胶原蛋白进行测试，评估其在不同浓度下的毒性和效应，对于经过改进的编辑后产物，进行长期评估，观察编辑后产物的持久性效果和潜在的长期毒性。
11、本专利技术有益效果为：本专利技术提供一种基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，cpf1在crispr-cas系统中具有较高的特异性，能够在基因组中实现精确的定点编辑，可以精准地将编辑目标定位到所需的三型胶原蛋白基因区域，避免不必要的编辑和副作用，基因组编辑可以优化三型胶原蛋白基因，以提高其表达水平和生产效率，导致编辑后植物细胞中产生更多活性的三型胶原蛋白，基于cpf1的定点编辑可以帮助筛选和改进编辑后的产物，以确保其在体内和体外表现出低毒性，通过定点编辑，可以精心设计编辑目标，以保留三型胶原蛋白的生物活性和功能，编辑后的产物可以在保持功能的同时，减少不必要的毒性或副作用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.基于Cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：包括，
2.如权利要求1所述的基于Cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述设计单导RNA序列具体包括，
3.如权利要求1所述的基于Cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述根据RNA序列构建Cpf1质粒具体包括，
4.如权利要求1所述的基于Cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述将制备好的质粒送入植物细胞具体包括，
5.如权利要求1所述的基于Cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述筛选编辑后的植物细胞并验证胶原蛋白表达具体包括，
6.如权利要求1所述的基于Cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述对三型胶原蛋白功能分析和毒性评估并改进优化具体包括，
【技术特征摘要】
1.基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：包括，
2.如权利要求1所述的基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述设计单导rna序列具体包括，
3.如权利要求1所述的基于cpf1的植物基因组定点编辑获取高活低毒素三型胶原蛋白的方法，其特征在于：所述根据rna序列构建cpf1质粒具体包括，
4.如权利要求1所述的基于cpf1的...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛向勇，
申请(专利权)人：肌茵美信使酶生命科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。