【技术实现步骤摘要】
本公开属于生物检测领域，具体涉及一种原位检测样品中的靶核酸序列的方法。
技术介绍
1、近年来，单细胞转录组测序（scrna-seq）技术发展迅速，为获得单细胞中的转录组信息提供了强大的工具。尽管单细胞转录组测序技术可以高通量地获得单细胞的基因表达信息，但无法获得基因表达的空间维度信息。表达基因的位置信息对于研究组织和器官发育、细胞间通讯和异质性等科学问题至关重要。
2、现有的荧光原位杂交技术，如smfish、rnascope、merfish、osmfish和hcr等，都有明显的不足。例如，smfish的局限性在于信噪比低、对短转录物的敏感性较低、由标记探针的非特异性结合引起的假阳性信号以及同时检测多种rna分子能力的不足。seqfish和merfish的原理与smfish相似，它们需要大量的基因特异性探针、共聚焦或超分辨率显微镜来获取信号，以及用于探针设计和分析的复杂算法。然而，低信噪比仍然是这些方法的主要技术挑战，尤其是对于具有自发荧光强的组织切片。此外，由于seqfish和merfish依赖于高分辨成像，成像时间长，因此限制了其处理大面积样品的能力。商业化的方法，如rnascope具有使用成本较高、通量较低等限制，该方法也难以做到同时检测10个或更多基因。hcr技术具有很高的信号放大效率，但其可以同时检测的基因数量有限，无法实现基因表达的高通量检测。除了上述方法外，有基于挂锁探针和滚环扩增的原位杂交技术，如hybiss。这种方法首先在原位将rna逆转为cdna，然后使用挂锁探针靶向cdna，随后加入滚环扩增所需要
3、hybiss技术中的原位逆转录效率低下且通常成本很高，这一过程对于rna质量要求较高，容易造成rna信息丢失。scrinshot技术中使用的可以催化两个相邻dna单链与互补rna单链之间连接反应的sprint r酶，该酶的连接活性和特异性受到连接位点碱基类型、互补碱基数量、实验温度和实验系统中离子浓度的影响。
4、以上两种技术需要合成大量磷酸化的挂锁探针，且这些探针只针对一个靶序列，无法适用于其他靶序列，这极大的提高了成本。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本公开的目的是提供一种新型的、高分辨率、高信噪比、高灵敏度、可复用（低成本）的原位检测样品中靶核酸序列的方法。
2、本公开的一方面提供了一种检测样品中的靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
3、（a）提供至少一对分裂探针对和至少一个挂锁探针，
4、（b）将所述样品与所述分裂探针对接触，使所述分裂探针对与所述靶核酸杂交，
5、（c）添加所述挂锁探针，使所述挂锁探针与所述分裂探针对部分杂交，形成带有切口的核酸环，
6、（d）使用连接酶，使所述带有切口的核酸环形成封闭的核酸环，
7、（e）在聚合酶的存在下，以所述封闭的核酸环作为模板进行滚环扩增，获得滚环扩增产物。
8、在一些实施方式中，所述分裂探针对包含第一分裂探针和第二分裂探针。
9、在一些实施方式中，所述第一分裂探针和/或第二分裂探针包括5’端单链区、茎链区和3’端单链区。
10、在一些实施方式中，所述第一分裂探针的5’端单链区或3’端单链区与所述靶核酸的第一部分杂交形成第一互补结合区，所述第二分裂探针的5’端单链区或3’端单链区与所述靶核酸的第二部分杂交形成第二互补结合区。
11、在一些实施方式中，所述第一分裂探针的5’端单链区或3’端单链区与所述挂锁探针的5’端单链区和3’端单链区杂交形成第三互补结合区，所述第二分裂探针的5’端单链区或3’端单链区与所述挂锁探针部分杂交形成第四互补结合区。
12、在一些实施方式中，所述第二分裂探针的5’端单链区或3’端单链区与所述挂锁探针的5’端单链区和3’端单链区杂交形成第三互补结合区，所述第一分裂探针的5’端单链区或3’端单链区与所述挂锁探针部分杂交形成第四互补结合。
13、在一些实施方式中，步骤（e）中，所述滚环扩增以所述分裂探针中的一个分裂探针作为引物，或者以额外添加的引物探针作为引物，其中，所述引物探针与所述挂锁探针的一部分特异性结合。优选地，所述引物探针还与第二分裂探针部分特异性结合。更优选地，所述引物探针进一步与靶核酸特异性结合。
14、在一些实施方式中，所述切口位于所述第三互补结合区。
15、在一些实施方式中，所述第一分裂探针和/或所述第二分裂探针的长度为至少20个核苷酸，优选为20-80个核苷酸，例如可以为20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个或80个核苷酸。
16、在一些实施方式中，所述5’端单链区的长度为8-40个核苷酸，例如可以为10个、15个、20个、25个、30个、35个或40个核苷酸。
17、在一些实施方式中，所述茎链区的长度为2-6个核苷酸，例如可以为2个、3个、4个、5个或6个核苷酸。
18、在一些实施方式中，所述3’端单链区的长度为8-40个核苷酸，例如可以为8个、10个、15个、20个、25个、30个、40个核苷酸。
19、在一些实施方式中，第一互补结合区和/或第二互补结合区的长度为至少10个核苷酸，优选为10-40个核苷酸，例如可以为10个、14个、15个、20个、25个、30个、35个或40个核苷酸。
20、在一些实施方式中，所述第二分裂探针的3’端最后3-5个碱基之间的不进行修饰或进行能阻断聚合酶的3’端至5’端外切酶活性的修饰。在一些实施方式中，所述第二分裂探针的3’端最后3-5个碱基之间进行硫代修饰。
21、在一些实施方式中，所述第二分裂探针的3’末端碱基不进行修饰，或进行倒置dt/dg修饰和/或其他阻断聚合酶延伸反应的修饰。
22、在一些实施方式中，所述至少一对分裂探针对中的一部分第二分裂探针的3’端是经修饰的。
23、在一些实施方式中，所述第二分裂探针的3’端最后3-5个碱基之间进行硫代修饰。这种硫代修饰通常指在碱基（或核苷酸）之间引入硫代磷酸酯键，使得核苷酸间的连接能抵抗核酸聚合酶的3’端至5’端外切酶的活性，即避免phi29 聚合酶的外切酶活性。可根据实际情况选择使用。
24、在一些实施方式中，所述第二分裂探针的3’末端进行倒置dt/dg修饰或其他阻断聚合酶延伸反应的修饰。当所检测靶核酸含量较高时，为保证检测效率和检测灵敏度，在所述第二分裂探针的3’端添加倒置的dt/dg，导致3’-3’连接，从而抑制3’外切核酸酶的降解和dna聚合酶的延伸。
25、在一些实施方式中，所述挂锁探针的长度为至少40个核苷酸，优选为40-160个核苷酸，例如可以为40个、45个本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种原位检测样品中的靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分裂探针对包含第一分裂探针和第二分裂探针，和/或
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一分裂探针和/或第二分裂探针包括5’端单链区、茎链区和3’端单链区，
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一分裂探针和/或所述第二分裂探针的长度为至少20个核苷酸，和/或
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述挂锁探针的长度为至少40个核苷酸，和/或
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：步骤（f）将所述滚环扩增产物与读出探针和/或放大探针接触，获取靶核酸的空间位置和/或序列信息。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述读出探针与所述读出序列杂交，和/或
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤（f）之前，将含有滚环扩增产物的组织样品进行组织透明化处理。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述组织透
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸为RNA或DNA，
11. 一种用于原位检测样品中的靶核酸序列的探针组，包含至少一对分裂探针对和至少一个挂锁探针。
12.根据权利要求11所述的探针组，其特征在于，所述分裂探针对包含第一分裂探针和第二分裂探针，和/或
13.根据权利要求12所述的探针组，其特征在于，所述第一分裂探针和/或第二分裂探针包括5’端单链区、茎链区和3’端单链区，其中，所述第一分裂探针的5’端单链区或3’端单链区能够与所述靶核酸的第一部分杂交形成第一互补结合区，所述第二分裂探针的5’端单链区或3’端单链区能够与所述靶核酸的第二部分杂交形成第二互补结合区，和/或
14. 根据权利要求11所述的探针组，其特征在于，所述探针组还包括读出探针和/或放大探针。
15. 根据权利要求14所述的探针组，其特征在于，所述读出探针与所述读出序列杂交，和/或
16.一种试剂盒，包括权利要求11-15中任一项所述的探针组以及连接酶和/或聚合酶。
17.根据权利要求1-10任一项所述的方法、权利要求11-15中任一项所述的探针组、权利要求16所述的试剂盒在原位检测以及流式细胞术中的应用。
18.一种原位检测样品中的靶核酸序列的系统，所述系统包括：
19.根据权利要求18所述的系统，其特征在于，所述分裂探针和所述挂锁探针如权利要求11-15中任一项所述的探针组中所限定的。
...【技术特征摘要】
1.一种原位检测样品中的靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分裂探针对包含第一分裂探针和第二分裂探针，和/或
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一分裂探针和/或第二分裂探针包括5’端单链区、茎链区和3’端单链区，
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一分裂探针和/或所述第二分裂探针的长度为至少20个核苷酸，和/或
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述挂锁探针的长度为至少40个核苷酸，和/或
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：步骤（f）将所述滚环扩增产物与读出探针和/或放大探针接触，获取靶核酸的空间位置和/或序列信息。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述读出探针与所述读出序列杂交，和/或
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤（f）之前，将含有滚环扩增产物的组织样品进行组织透明化处理。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述组织透明化处理包括：首先将滚环扩增产物与其周围的组织进行固定，再将固定后的组织样品与美法仑x、丙烯酰-x, se进行反应，然后将所述反应的产物与凝胶接触，使所述滚环扩增产物进一步固定在所述凝胶上；和，将固定有所述滚环扩增产物的凝胶进行酶解处理。
10.根据权利要求1所述的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：段力辉，李芽，黄元，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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