【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测领域，特别涉及一种基于cas免扩增核酸检测方法及其应用。
技术介绍
1、成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindrome repeats，crispr)及其相关蛋白(crispr associated proteins，cas)基因组成的crispr/cas系统是细菌和古细菌的获得性免疫系统，通过特异性识别并剪切噬菌体或质粒等的特定序列进而抵御外源遗传物质的入侵。crispr/cas系统在机理基本明确后就被开发用于基因编辑，并以其特异性高、可编程性强、简单高效等特点迅速从众多具有竞争力的基因编辑技术中脱颖而出，为体内基因编辑带来了革命性突破。2016年pardee等运用crispr/cas9系统开发了一种区分寨卡病毒亚型的分子传感器，自此crispr/cas系统逐渐进入核酸检测领域，为体外诊断开拓了新的方向。随后相继发现结构单一、分子量小的cas13a、cas12a和cas14a1等蛋白，这些蛋白既具有各自的特性，又在与向导rna(guiderna，grna)形成的复合物特异性识别结合目标核酸后，均具有非特异性切割的反式切割活性，从而被广泛应用于核酸检测。
2、crispr/cas系统中crispr rna(crrna)引导的cas蛋白与靶核酸结合的亲和力有限，直接进行核酸检测的检出限约为pm水平，这灵敏度很难满足临床诊断的要求。因此，为了获得更高的检测灵敏度，大部分基于cas的核酸检测技术需要对目标核酸进行预扩增(常见的
3、为了克服crispr/cas核酸检测技术需要靶核酸预扩增的局限性，降低操作难度和可能的交叉污染风险，科学家们探索了多种基于crispr/cas系统的免扩增核酸检测策略。目前，针对crispr/cas系统的反应动力学过程建立的免扩增crispr/cas检测策略主要分为4大类。一是对crispr/cas系统的crrna进行优化。最优的crrna长度以及碱基组成往往能使cas蛋白发挥最佳的酶切能力，而且多种crrna组合在一起可以显著提高crispr/cas核酸检测技术的检测灵敏度。fozouni和zeng等利用多种crrna协同组合提高单一靶核酸的激活效率，构建免扩增检测平台。二是构建数字crispr/cas超灵敏检测平台。通过将crispr/cas反应体系限制在皮升或飞升大小的反应体积中来提高靶核酸的反应浓度，以达到仪器可检出水平，实现免扩增核酸检测。三是crispr/cas系统偶联其他灵敏信号传感器，比如电化学标签-金属电极传感器、纳米孔、表面增强拉曼散射生物传感器、石墨烯场效应管等。通过设计相关探针，将核酸识别的信号转化为电信号或拉曼散射信号，提高检测灵敏度。四是级联信号放大检测策略。主要包括串联蛋白酶反应系统与核酸回路系统。crispr/cas核酸检测技术的检测灵敏度受限于单一cas蛋白的催化效率，因此将不同类型的多个cas蛋白串联或cas蛋白与其他酶串联，可以实现信号的级联放大。核酸回路系统通常是设计具有一定结构的探针作为中间体。当cas效应蛋白被目标核酸激活后，非特异性切割中间体，导致中间产物转化，继续激活cas效应蛋白，从而激发后续的核酸循环回路，形成信号指数级放大，如催化发夹组装、crispr/cas自催化放大网络(conan)等。四大类免扩增crispr/cas检测策略中，多种crrna协同组合成本高并且可能会发生更多的脱靶事件，导致假阳性结果，靶标微量化检测步骤复杂，电化学传感器的重现性一直都是业界的难题，相比较而言针对crispr/cas体系的级联信号放大检测策略是最有价值的研究方向。但是级联信号放大检测策略中的串联蛋白酶反应系统需要多个酶，成本高；催化发夹组装需要联合电化学生物传感器，操作复杂；conan检测需要两条grna，而grna的合成比dna的合成更复杂，昂贵，并且检测时间长达4小时，检测周期较长。因此需要进一步开发出反应条件温和，灵敏度高，检测时间短，操作简便，适宜于现场部署和即时检测的基于cas免扩增基因检测新技术。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种基于cas免扩增核酸检测方法，该方法具有灵敏度高，检测时间短，操作简便的优点，具有即时检测的潜力。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种scdna，是通过采用不完全互补配对的idna与靶ssdna退火杂交形成的具有ssdna凸起的双链结构，所述scdna上的ssdna凸起能被活化的cas蛋白非特异切割。
4、如图1所示，scdna上形成一个能够被活化的cas蛋白非特异切割的单链dna凸起。
5、当一条dna单链上有连续多个碱基与其互补链不互补配对时，这两条dna单链退火杂交，不互补配对的碱基就会形成单链dna凸起结构。单链dna凸起结构产生于不完全互补配对的两条dna单链的杂交。
6、在其中一个优选的实施例中，scdna上的ssdna凸起两端的t碱基分别被荧光基团和淬灭基团修饰。
7、在其中一个优选的实施例中，荧光基团包括6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，fam)、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro fluorescein，tet)、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(joe)、六氯-6-甲基荧光素(hex)、6-羧基四甲基若丹明(carboxytetramethyl rhodamine，tamra)和5h-吲哚菁(cy5)中的一种；所述淬灭基团包括与荧光基团相对应的无荧光淬灭基团1(black-hole-quencher 1，bhq1)、无荧光淬灭基团2(black-hole-quencher 2，bhq2)和无荧光淬灭基团3(black-hole-quencher 1，bhq3)中的一种。
8、在其中一个优选的实施例中，scdna的ssdna凸起两端的t碱基分别被fam荧光基团和bhq1淬灭基团修饰。
9、在其中一个优选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种scDNA，其特征在于，所述scDNA是通过采用不完全互补配对的iDNA与靶ssDNA退火杂交形成的具有ssDNA凸起的双链结构，所述scDNA上的ssDNA凸起能被活化的Cas蛋白非特异切割。
2.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，所述scDNA上的ssDNA凸起两端的T碱基分别被荧光基团和淬灭基团修饰。
3.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，被活化的Cas包括Cas12a、Cas12b、Cas13a或Cas14a1。
4.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，所述靶ssDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1- SEQ ID NO.12中任意一条所示。
5.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，iDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14- SEQID NO.20、SEQ ID NO.22-SEQ ID NO.32中任意一条所示。
6.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，ssDNA凸起的长度为7 nt-21 nt；ssDNA凸起的位置在靶ssDNA的3’端第11碱基与
7.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，靶ssDNA的序列长度不少于14 nt。
8.根据权利要求1-7任一项所述的scDNA，其特征在于，靶ssDNA与crRNA互补序列的长度为14 nt-20nt。
9.基于Cas免扩增核酸检测方法，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的基于Cas免扩增核酸检测方法，其特征在于，所述靶核酸为双链DNA、单链DNA或RNA。
11.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-7任一项所述的scDNA。
12.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas蛋白、crRNA和缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种scdna，其特征在于，所述scdna是通过采用不完全互补配对的idna与靶ssdna退火杂交形成的具有ssdna凸起的双链结构，所述scdna上的ssdna凸起能被活化的cas蛋白非特异切割。
2.根据权利要求1所述的scdna，其特征在于，所述scdna上的ssdna凸起两端的t碱基分别被荧光基团和淬灭基团修饰。
3.根据权利要求1所述的scdna，其特征在于，被活化的cas包括cas12a、cas12b、cas13a或cas14a1。
4.根据权利要求1所述的scdna，其特征在于，所述靶ssdna的核苷酸序列如seq idno.1- seq id no.12中任意一条所示。
5.根据权利要求1所述的scdna，其特征在于，idna的核苷酸序列如seq id no.14- seqid no.20、seq id no.22-seq id no.32中任意一条所示。
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