【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种通过代谢工程改造提高嗜热厌氧乙醇杆菌生物合成乳酸的方法，属于基因工程。
技术介绍
1、乳酸广泛应用于食品、饮料、医药、化妆品等领域。近年来，由于全球对环境保护日趋严格，生物基聚合物尤其是可完全生物降解且健康安全的聚乳酸材料备受关注。因此，作为聚乳酸的原材料乳酸单体的市场需求增长较快。目前乳酸生产主要由玉米等粮食为原料，如果大规模生产不但会消耗大量宝贵的粮食资源，也会出现与人和动物争粮食的情况。利用非粮原料(如秸秆)生产乳酸，不但可以节省粮食资源，而且原料来源广泛、价格便宜。秸秆等原料含有葡聚糖的同时还含有大量木聚糖等五碳糖，这些多聚糖被水解成单糖后需要全部发酵转化才能经济有效地生产乳酸等产品，而目前主要的生产菌株对五碳糖的代谢能力不足。
2、嗜热厌氧乙醇杆菌(thermoanaerobacter ethanolicus)有完整的己糖和戊糖代谢系统，同时它还能分泌半纤维素酶，能很好地利用秸秆等原料中的六碳糖和五碳糖。嗜热厌氧乙醇杆菌能在78摄氏度的高温下生长，并且它在ph4.4-9.8范围内都能生长，这有利于它在工业生产应用时可以很大程度上降低杂菌污染。然而野生嗜热厌氧乙醇杆菌发酵主要产出乙醇，同时分泌醋酸、乳酸等代谢产物，乳酸产率低，达不到工业生产应用的要求。因此，亟待解决嗜热厌氧乙醇杆菌乳酸产量低的问题，以期提高其生物合成乳酸的能力。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种乳酸合成能力提高的嗜热厌氧乙醇杆菌，是在出发菌株的基础上，抑制了磷酸乙酰基转移
2、在一种实施方式中，所述嗜热厌氧乙醇杆菌敲除或缺失了磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhe、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk中的一个或多个基因。
3、在一种实施方式中，所述嗜热厌氧乙醇杆菌敲除或缺失了磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhe、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk。
4、在一种实施方式中，所述磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、在一种实施方式中，所述乙醇脱氢酶基因adhe的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、在一种实施方式中，所述磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk的核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、在一种实施方式中，所述出发菌株为thermoanaerobacter ethanolicus jw200。
8、本专利技术还提供了所述嗜热厌氧乙醇杆菌在产乳酸方面的应用。
9、在一种实施方式中，所述应用是将所述嗜热厌氧乙醇杆菌接种至含碳源、氮源的培养基中，于37～78℃发酵一段时间。
10、在一种实施方式中，所述发酵的温度还可以为55-72℃，或55～65℃，或58～62℃。
11、在一种实施方式中，所述碳源包括但不限于葡萄糖。
12、在一种实施方式中，所述葡萄糖的含量≥5g/l。
13、在一种实施方式中，所述培养基还含有：二水合柠檬酸钠3.00g/l，(nh4)2so41.30g/l，kh2po4 1.43g/l，k2hpo4·3h2o 1.80g/l，cacl2·2h2o 0.13g/l，mgcl2·6h2o2.60g/l，酵母提取物4.50g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.50g/l，feso4·7h2o 0.0011g/l，3-(n-吗啡啉)丙磺酸钠10.00g/l。
14、本专利技术还提供了一种提高嗜热厌氧乙醇杆菌产乳酸能力的方法，所述方法是敲除或沉默磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhe、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk中的一个或多个基因。
15、本专利技术还提供了所述嗜热厌氧乙醇杆菌，或所述方法在生产乳酸、乳酸盐，或含乳酸的产品中的应用。
16、有益效果：本专利技术通过敲除ptaack、adhe及ptbbtk，提高了嗜热厌氧乙醇杆菌的乳酸质量产率，相比于出发菌株，单独敲除ptaack或adhe的乳酸质量产率从15％可提高到35％，双重敲除ptaack和adhe的乳酸质量产率可提高到60％，三重敲除ptaack、adhe和ptbbtk的乳酸质量产率可提高到89％以上。
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1.一种乳酸合成能力提高的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，在出发菌株的基础上，抑制了磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhE、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk中的一个或多个基因的表达。
2.根据权利要求1所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述嗜热厌氧乙醇杆菌敲除或缺失了磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhE、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk。
3.根据权利要求1或2所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1或2所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述乙醇脱氢酶基因adhE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1或2所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求1～5任一所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述
7.一种生产乳酸的方法，其特征在于，以权利要求1～6任一所述的嗜热厌氧乙醇杆菌为发酵微生物，在含碳源、氮源的培养基中，于37-78℃发酵一段时间。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述碳源包括但不限于葡萄糖。
9.一种提高嗜热厌氧乙醇杆菌产乳酸能力的方法，其特征在于，敲除或沉默磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhE、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk中的一个或多个基因。
10.权利要求1～6任一所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，或权利要求7～8任一所述的方法在产乳酸、乳酸盐，或生产含乳酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种乳酸合成能力提高的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，在出发菌株的基础上，抑制了磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhe、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk中的一个或多个基因的表达。
2.根据权利要求1所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述嗜热厌氧乙醇杆菌敲除或缺失了磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack、乙醇脱氢酶基因adhe、磷酸丁酰基转移酶基因和丁酸激酶基因ptbbtk。
3.根据权利要求1或2所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述磷酸乙酰基转移酶基因和乙酸激酶基因ptaack的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求1或2所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述乙醇脱氢酶基因adhe的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求1或2所述的嗜热厌氧乙醇杆菌，其特征在于，所述磷酸丁酰基转移...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵雄俊，张元心，王关应，杨军丽，戴东，
申请(专利权)人：宁波牛形山生物科技合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：
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