【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料领域，涉及一种基于细胞因子的肝脏生物打印复合墨水、制备方法及应用。
技术介绍
1、肝脏是人体内最大的实质性器官，控制着体内血糖和氨的水平、多种激素的合成、铁和一些维生素的储存以及很多内源性和外源性毒物的清除；作为药物代谢的重要场所，药物进入人体后经过肝脏进行生物转化，通常情况下，低剂量药物经过i相反应，变为极性或水溶性较高而活性低的代谢物，药物本身活性基团及其代谢活化过程中产生的亲电子基团、自由基等，通过与谷胱甘肽(gsh)结合而解毒，再经过ii相的结合作用，通过胆汁或尿液排到体外，并不会产生严重的肝毒性。但当药物服用过量时，或者因遗传性特点致使药物代谢异常时，活性基团和自由基等耗竭了肝脏内的gsh，导致氧化应激反应，最终导致肝损伤。药物性肝损伤(dili)是药物后期失败和药物退出市场的主要原因。
2、常用的药物肝毒性评价方法主要为二维细胞培养、动物模型等，但无法满足准确模拟肝脏组织/器官的生理表现、肝细胞与微环境之间的相互作用的要求。三维(3d)生物打印技术作为一个新兴的跨学科前沿领域，在过去为构建具有生物功能的组织提供了各种策略。
3、三维(3d)生物打印，用于制造与原生的层次结构相似的生物结构。通过自动分配系统直接在基质或组织培养皿上打印和形成细胞或其他生物实体。此过程将多种类型细胞结合在一起，形成所需的三维功能结构。生物打印的重点在于生物墨水，生物墨水由细胞、基础骨架材料和其他必要成分组成，可以以细胞来源创建新的和功能性的3d组织。
4、生物打印可以制造更精确的肝
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决缺少仿生生物打印肝脏墨水的问题，提供一种基于细胞因子的肝脏生物打印复合墨水的制备方法，该方法利用温控及离子交联，两步法固化生物材料得到可控分布的水凝胶支架，通过添加明胶来延缓海藻酸盐降解时间以及可成型性，并且引入肝脱细胞外基质(decm)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、肝细胞生长因子(hgf)以及纤连蛋白(fn)来增加复合墨水的仿生性，提供更加接近人体的培养微环境。
2、为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一种基于细胞因子的肝脏生物打印复合墨水，体内细胞因子以与细胞外基质结合的形式存在，本专利技术通过引入多种细胞因子增加了所构建微环境的稳定性，防止其被蛋白酶水解，可以延长其作用时间。该肝脏生物打印复合墨水主要由溶剂、海藻酸钠、明胶、肝脱细胞外基质、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子以及纤连蛋白组成，溶剂为dmem/f12液体培养基。
4、进一步，所述肝脏生物打印复合墨水中，海藻酸钠、明胶、肝脱细胞外基质与溶剂的体积比为1-5％、3-8％、1-5％；表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、纤连蛋白在肝脏生物打印复合墨水中的浓度为10-50ng/ml、10-50ng/ml、5-30ng/ml、5-50ng/ml。
5、一种基于细胞因子的肝脏生物打印复合墨水的制备方法，包括以下步骤：
6、(1)将海藻酸钠、明胶紫外照射灭菌，加入dmem/f12液体培养基溶解，得到海藻酸钠和明胶混合物，4℃保存备用；(2)往肝脱细胞外基质中加入步骤(1)所得海藻酸钠和明胶混合物，形成肝脱细胞外基质生物墨水；(3)往步骤(2)所得脱细胞外基质生物墨水中添加表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子以及纤连蛋白，得到肝脏生物打印复合墨水。
7、一种基于细胞因子的肝脏生物打印复合墨水制备高仿生肝脏体外模型的方法，包括以下步骤：(1)将现提取的原代肝实质细胞用dmem/f12液体培养基悬浮，然后加入肝脏生物打印复合墨水，形成含有原代肝实质细胞的外层肝脏生物打印复合墨水；将星状细胞与内皮细胞用dmem/f12液体培养基悬浮，加入肝脱细胞外基质生物墨水，形成含有两种非实质细胞的内层生物墨水；(2)将含有原代肝实质细胞的外层肝脏生物打印复合墨水与含有非实质细胞的内层生物墨水装于3d生物打印机料筒中，通过计算机程序控制，将肝脏生物打印复合墨水挤出到低温打印台上，形成肝脏模型；肝脏模型包括一层墨水层；(3)将初步打印肝脏模型进行钙离子交联，固化形成异质水凝胶结构。制备所得的水凝胶支架的挤出线宽为0.3-0.5mm。
8、进一步，所述肝脏生物打印复合墨水中原代肝细胞的最终浓度为104-108/ml。
9、进一步，步骤(3)中将肝脏模型放入浓度为20-200mm(优选100mm)的氯化钙水溶液中交联1-10min，优选5min，然后后使用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次。氯化钙溶液交联根据钙离子与海藻酸盐离子的螯合作用形成稳定水凝胶的原理，可以改善低浓度海藻酸钠易降解问题。
10、进一步，打印参数包括：生物打印机的打印速度为6-30mm/s，喷嘴内径为0.3-0.5mm。
11、进一步，所述肝脱细胞外基质(decm)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、肝细胞生长因子(hgf)以及纤连蛋白(fn)选自人或动物，在生物打印过程中可以维持良好的生理功能表征。
12、进一步，所述非实质细胞选自人或动物的肝实质细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞。
13、肝脏微环境由肝实质细胞、肝非实质细胞(肝星状细胞、巨噬细胞、窦状内皮细胞)以及细胞外基质和神经系统等复杂交汇形成，本专利技术通过引用细胞外基质可以通过调节海藻酸钠孔隙度影响本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于细胞因子的肝脏生物打印复合墨水，其特征在于，该肝脏生物打印复合墨水主要由溶剂、海藻酸钠、明胶、肝脱细胞外基质、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子以及纤连蛋白组成，溶剂为DMEM/F12液体培养基。
2.根据权利要求1所述的肝脏生物打印复合墨水，其特征在于，所述肝脏生物打印复合墨水中，海藻酸钠、明胶、肝脱细胞外基质与溶剂的体积比为1-5％、3-8％、1-5％；表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、纤连蛋白在肝脏生物打印复合墨水中的浓度为10-50ng/mL、10-50ng/mL、5-30ng/mL、5-50ng/mL。
3.权利要求1所述肝脏生物打印复合墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将海藻酸钠、明胶紫外照射灭菌，加入DMEM/F12液体培养基溶解，得到海藻酸钠和明胶混合物，4℃保存备用；(2)往肝脱细胞外基质中加入步骤(1)所得海藻酸钠和明胶混合物，形成肝脱细胞外基质生物墨水；(3)往步骤(2)所得脱细胞外基质生物墨水中添加表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子以及纤连蛋白，得到肝脏生物打印复
4.采用权利要求1所述的肝脏生物打印复合墨水制备高仿生肝脏体外模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将现提取的原代肝实质细胞用DMEM/F12液体培养基悬浮，然后加入肝脏生物打印复合墨水，形成含有原代肝实质细胞的外层肝脏生物打印复合墨水；将星状细胞与内皮细胞用DMEM/F12液体培养基悬浮，加入肝脱细胞外基质生物墨水，形成含有两种非实质细胞的内层生物墨水；(2)将含有原代肝实质细胞的外层肝脏生物打印复合墨水与含有非实质细胞的内层生物墨水装于3D生物打印机料筒中，通过计算机程序控制，将肝脏生物打印复合墨水挤出到低温打印台上，形成肝脏模型；肝脏模型包括一层墨水层；(3)将初步打印肝脏模型进行钙离子交联，固化形成异质水凝胶结构。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述肝脏生物打印复合墨水中原代肝细胞的最终浓度为104-108/mL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将肝脏模型放入浓度为20-200mM的氯化钙水溶液中交联1-10min，后使用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次。
...【技术特征摘要】
1.一种基于细胞因子的肝脏生物打印复合墨水，其特征在于，该肝脏生物打印复合墨水主要由溶剂、海藻酸钠、明胶、肝脱细胞外基质、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子以及纤连蛋白组成，溶剂为dmem/f12液体培养基。
2.根据权利要求1所述的肝脏生物打印复合墨水，其特征在于，所述肝脏生物打印复合墨水中，海藻酸钠、明胶、肝脱细胞外基质与溶剂的体积比为1-5％、3-8％、1-5％；表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、纤连蛋白在肝脏生物打印复合墨水中的浓度为10-50ng/ml、10-50ng/ml、5-30ng/ml、5-50ng/ml。
3.权利要求1所述肝脏生物打印复合墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将海藻酸钠、明胶紫外照射灭菌，加入dmem/f12液体培养基溶解，得到海藻酸钠和明胶混合物，4℃保存备用；(2)往肝脱细胞外基质中加入步骤(1)所得海藻酸钠和明胶混合物，形成肝脱细胞外基质生物墨水；(3)往步骤(2)所得脱细胞外基质生物墨水中添加表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子以及纤连蛋白...
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