【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物重组，尤其涉及一种酿酒酵母seb21及其构建方法与应用。
技术介绍
1、随着能源危机和环境污染问题日趋严重，可再生清洁能源燃料乙醇受到极大关注。以玉米、木薯等淀粉基原料生产乙醇存在生产成本高、“与人争粮、与粮争地”的问题。以秸秆等农业废弃生物质为原料的纤维素乙醇是我国燃料乙醇的主要发展方向。木质纤维素生物质含有大量葡萄糖和木糖，将它们高效转化为乙醇是秸秆燃料乙醇生产的关键技术。酿酒酵母常用于传统燃料乙醇生产，具有鲁棒性和良好的葡萄糖代谢能力，是利用木质纤维素生产燃料乙醇的理想底盘，但它不能代谢木糖。为了获得木糖代谢能力，通常在酿酒酵母中表达异源的木糖代谢途径——木糖异构酶(xi)途径或木糖还原酶和木糖醇脱氢酶(xr-xdh)途径。两条木糖代谢路径各有优势和不足：xi途径不依赖辅酶、乙醇收率高，但xi表达活性低导致木糖代谢速率低；xr-xdh菌株的木糖代谢速率较高，但xr和xdh的辅酶偏好不同导致辅酶氧化还原失衡，中间产物木糖醇大量积累导致乙醇收率低。为了提升重组菌株的木糖代谢能力，大量研究围绕糖转运、胞内氧化还原平衡/xi活性及下游代谢途径等进行代谢工程改造，并结合诱变、适应性进化等非理性育种手段来提高重组菌株的木糖代谢速率和乙醇收率，并取得一定成果。但是，相比于葡萄糖代谢，重组菌株的木糖代谢速率和乙醇收率仍需进一步提升。在酿酒酵母中表达野生型xr(nadph-偏好型xr)有助于提升木糖代谢速率，表达双突变xr(nadh-偏好型xr)有助于提升乙醇收率。另外，酵母内源xdh对木酮糖的亲和性高于对木糖醇的亲和性
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种酿酒酵母seb21及其构建方法与应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
3、本专利技术的第一方面是提供一种高效利用五碳糖或/和六碳糖发酵的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株为saccharomyces cerevisiae seb21，保藏编号为cgmcc no.24792，保藏日期为2022年04月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
4、本专利技术的第二方面是提供一种用于构建如前所述酿酒酵母菌株的质粒pmel-gxyl2，所述质粒pmel-gxyl2由质粒pmel13的线性骨架与grna-xyl2通过同源重组连接而得；
5、所述grna-xyl2包括：两端与质粒pmel13的线性骨架同源的序列以及酿酒酵母内源xyl2编码序列内的grna识别序列。
6、优选地，所述grna-xyl2的碱基序列如seq id no:1-2所示；
7、xyl2_tgr f(seq id no:1)：tgcgcatgtttcggcgttcgaaacttctccgcagtgaaagataaatgatctgtcgcagcaaattttaaatgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac；
8、xyl2_tgr r(seq id no:2)：gttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacatttaaaatttgctgcgacagatcatttatctttcactgcggagaagtttcgaacgccgaaacatgcgca；
9、其中，grna识别序列如下划线标识的碱基序列所示。
10、本专利技术的第三方面是提供一种如前所述酿酒酵母菌株的构建方法，步骤包括：
11、s1、将质粒cas9-nat导入至酿酒酵母seb5；
12、s2、将如前所述的质粒pmel-gxyl2以及ptdh3-xyl1(k270rn272d)-ttdh3片段导入至含有质粒cas9-nat的酿酒酵母seb5；
13、s3、将含有目标基因的酿酒酵母seb5中的质粒cas9-nat以及质粒pmel-gxyl2脱除，即得酿酒酵母seb21。
14、优选地，所述酿酒酵母seb5的保藏编号为cgmcc no.11325，保藏日期为2015年09月06日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
15、优选地，步骤s1还包括：将质粒cas9-nat导入至酿酒酵母seb5后，通过菌落pcr验证所述酿酒酵母seb5中是否含有质粒cas9-nat。
16、优选地，所述ptdh3-xyl1(k270rn272d)-ttdh3片段由质粒pkx1(d)x2xk经引物扩增而得。
17、优选地，所述引物的碱基序列如seq id no:3-4所示。
18、mxyl1-re f(seq id no:3)：gctattgttctagagcgacctggtaaaatcaccctaactaatgtcagcatccccacgctttttcagttcgagtttatc；
19、mxyl1-re r(seq id no:4)：attccaacttgaacgatcgttccacctgccttacagacttcgatgcctgcactcactatagggcgaattggagct。
20、优选地，步骤s2还包括：将如前所述的质粒pmel-gxyl2以及ptdh3-xyl1(k270rn272d)-ttdh3片段导入至含有质粒cas9-nat的酿酒酵母seb5后，通过菌落pcr验证含有质粒cas9-nat以及质粒pmel-gxyl2的酿酒酵母seb5中是否含有目标基因。
21、本专利技术的第四方面是提供一种如前所述酿酒酵母菌株在秸秆预处理实际物料预糖化-同步糖化发酵中的应用。
22、本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
23、本专利技术以具有木糖代谢能力且表达野生型xr的工业菌株seb5为出发菌株，利用crispr/cas9基因编辑技术在酵母内源xyl2位点导入双突变xr(k270r-n272d)获得工程菌株seb21，相比出发菌株，该菌株的木糖代谢速率和乙醇收率得到明显提高。
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1.一种高效利用五碳糖或/和六碳糖发酵的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株为Saccharomyces cerevisiae SEB21，保藏编号为CGMCC No.24792，保藏日期为2022年04月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种用于构建如权利要求1所述酿酒酵母菌株的质粒pMEL-gXYL2，其特征在于，所述质粒pMEL-gXYL2由质粒pMEL13的线性骨架与gRNA-XYL2通过同源重组连接而得；
3.根据权利要求2所述的质粒pMEL-gXYL2，其特征在于，所述gRNA-XYL2的碱基序列如SEQ ID NO:1-2所示。
4.一种如权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，步骤包括：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母SEB5的保藏编号为CGMCC No.11325，保藏日期为2015年09月06日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S1还包括：将质粒Cas9-NAT导入至酿酒酵母SEB5后，通过菌落PCR验证所述酿酒酵母SEB5中是否含有质粒Cas9-NAT。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述PTDH3-XYL1(K270RN272D)-TTDH3片段由质粒pKX1(D)X2XK经引物扩增而得。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述引物的碱基序列如SEQ ID NO:3-4所示。
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S2还包括：将如权利要求2所述的质粒pMEL-gXYL2以及PTDH3-XYL1(K270RN272D)-TTDH3片段导入至含有质粒Cas9-NAT的酿酒酵母SEB5后，通过菌落PCR验证含有质粒Cas9-NAT以及质粒pMEL-gXYL2的酿酒酵母SEB5中是否含有目标基因。
10.一种如权利要求1所述酿酒酵母菌株在秸秆预处理实际物料预糖化-同步糖化发酵中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高效利用五碳糖或/和六碳糖发酵的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株为saccharomyces cerevisiae seb21，保藏编号为cgmcc no.24792，保藏日期为2022年04月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种用于构建如权利要求1所述酿酒酵母菌株的质粒pmel-gxyl2，其特征在于，所述质粒pmel-gxyl2由质粒pmel13的线性骨架与grna-xyl2通过同源重组连接而得；
3.根据权利要求2所述的质粒pmel-gxyl2，其特征在于，所述grna-xyl2的碱基序列如seq id no:1-2所示。
4.一种如权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，步骤包括：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母seb5的保藏编号为cgmcc no.11325，保藏日期为2015年09月06日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢采芸，陈栋，汤岳琴，缪晡，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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