【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及冠状病毒，具体领域为mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒、细胞系的构建和用于药物筛选的方法。
技术介绍
1、中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome，mers)自2012年在中东地区爆发以来，涉及的国家和地区27个，其中以沙特阿拉伯报道的病例最多，死亡率高达35％。而引起中东呼吸综合征的动物性病原——中东呼吸综合征冠状病毒(middle eastrespiratory syndrome coronavirus，mers-cov)，其直接来源宿主为单峰骆驼。mers-cov在系统发育上与bat coronavirus hku4和bat coronavirus hku5以及蝙蝠mers相关冠状病毒(mers-related coronavirus，mersr-cov)相近，表明这些冠状病毒具有共同的进化起源，并将其统称为蝙蝠mers簇冠状病毒。
2、专利技术人研究团队基于前期基分离获得的病毒，对mjhku4r cov-1开展的跨种传播风险相关研究，通过实验已经证实其能利用人dpp4作为受体，因此需要对其展开相关预警预测研究。
3、目前，国内针对冠状病毒的药物筛选和测试大多基于活病毒，需要专业人员在生物安全3级实验室进行操作，但是大多数实验室不具备这些实验条件。并且，基于活病毒的药物筛选和测试操作繁琐、通量低、成本高。因此，开发一种安全、高效的高通量化合物筛选和测试方法是目前亟待解决的问题。
技术实现思路<
1、本专利技术的第一目的在于提供mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒及其构建方法。
2、本专利技术的第二目的在于提供mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子细胞系及其构建方法。
3、本专利技术的第三目的在于提供mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒及mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子细胞系的用途。
4、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
5、一种mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒，是一个构建在bac载体上的cdna克隆，克隆简图如图1所示。该克隆包括mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4rcov-1基因组的5’端和3’端utr序列、完整的复制酶基因orf1a、orf1b基因和核衣壳蛋白n基因；除此之外，在包膜蛋白(e)基因和膜蛋白(m)基因的转录调控序列(trs)下游分别插入了新霉素磷酸转移酶基因(neo)和nanoluc荧光素酶报告基因。该载体还包括cmv真核启动子、hdv核酶和bgh终止信号。其中，复制子质粒序列如seq id no：1所示。
6、mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒的构建方法，具体为：
7、将mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1病毒基因组5’端utr区域和orf1a/orf1b基因的序列分割成6个连续的片段a-f；
8、分别构建并扩增片段g、h、i，其中片段g包含：e基因的转录调控序列trs-e(transcription-regulating sequence，trs)、新霉素磷酸转移酶基因neo；片段h包含m基因的trs-m和nanoluc荧光素酶报告基因；片段i包含n基因的trs-n基因以及mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1基因组3’端utr序列，并在片段两端引入ⅱ类限制性酶切位点，最后将各片段克隆至pgem-t easy载体。使用ⅱ类限制性内切酶将a-i各片段从各质粒上酶切下来，通过体外连接插入至酶切后的pbelobac11载体上。
9、一种mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子细胞系的构建方法，因设计构建mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒含有新霉素抗性基因，因此可使用新霉素(g418)进行包含mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子的稳定表达细胞系的筛选。具体为：通过利用脂质体转染试剂，将mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4rcov-1复制子质粒转染至bhk21细胞(来源atcc)，然后在0.5mg/ml新霉素g418的条件选择环境压力下进行细胞筛选，待处理2周后，利用胰酶将其细胞进行单克隆化；
10、将细胞稀释至平均每100μl培养基含有0.8个细胞，然后将细胞加入96孔板，每孔100μl，并且加入含有新霉素g418的培养基培养，直至单个细胞生长为单个成片的细胞，分别将每孔细胞用胰酶消化下来扩大培养；
11、最后挑选长势良好的1个mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子细胞系铺至24孔板，48h后使用细胞裂解液将细胞裂解下来，通过免疫印迹检测mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1n蛋白是否表达及通过使用nanoluc荧光素酶底物检测试剂盒测定细胞中的荧光素酶活性。
12、本专利技术所述的mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒及mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子细胞系在体外筛选或检测mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4rcov-1预防药物或治疗药物中的应用。具体包括以下两种方法：
13、(1)将mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒转染细胞，在细胞上加入预防药物及治疗药物，进行预防药物及治疗药物的细胞水平药效评估，处理后检测化学发光强度。
14、(2)通过直接利用mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子细胞系，加入预防及治疗药物，进行预防药物及治疗药物的细胞水平药效评估，处理后检测化学发光强度。
15、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
16、本专利技术针对mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1构建了复制子质粒和复制子细胞系。并基于该复制子质粒和复制子细胞系，建立了一套安全、高效的筛选和测试药物的系统和方法，可用于靶向mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1基因组复制和转录过程中，与复制酶相关的病毒蛋白和宿主因子的药物筛选和测试。无论mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒或其细胞系均可保证在实验过程中不涉及且不产生活病毒粒子，表明该系统可以在低生物安全等级实验室进行操作，比传统进行相关活病毒粒子的实验操作更安全、方便且成本低。该系统包含nanoluc荧光素酶报告基因，测试方便快捷，结果分析标准化，可以应用于高通量筛选。另外，该系统理论上其复制子质粒可适用于任何细胞系，该复制子细胞系能够保持长期稳定，能够极大的降低对于相关药物评测的条件及要求，可利用该复制子质粒及其细胞系进行大规模药物筛选的应用。
17、本专利技术方法对于mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1的抗病毒药物筛选具有重要的应用价值，有效避免了现有技术中针对mers簇穿山甲冠状本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子质粒，其特征在于：包括MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1基因组的5’端和3’端UTR序列、复制酶基因ORF1a、ORF1b基因和核衣壳蛋白N基因，以及新霉素磷酸转移酶Neo基因和Nanoluc荧光素酶报告基因，上述基因被插入在CMV真核启动子、HDV核酶和BGH终止信号的pBeloBAC11载体上；其中，MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子质粒序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子质粒的构建方法，其特征在于：将MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1病毒基因组5’端UTR区域和ORF1a/ORF1b基因的序列分割成6个连续的片段A-F；
3.一种MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子细胞系的构建方法，其特征在于：通过利用脂质体转染试剂，将MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子质粒转染至BHK21细胞，然后在0.5mg/ml新霉素G418的条
4.采用权利要求3所述构建方法获得的MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子细胞系。
5.权利要求1所述的MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子质粒及权利要求4所述的MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子细胞系在体外筛选或检测MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1预防药物或治疗药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子质粒、细胞系在体外筛选或检测MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1预防药物或治疗药物中的应用，其特征在于：将MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子质粒转染细胞，在细胞上加入预防药物及治疗药物，进行预防药物及治疗药物的细胞水平药效评估，处理后检测化学发光强度；或者，通过直接利用MERS簇穿山甲冠状病毒MjHKU4r CoV-1复制子细胞系，加入预防及治疗药物，进行预防药物及治疗药物的细胞水平药效评估，处理后检测化学发光强度。
...【技术特征摘要】
1.一种mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒，其特征在于：包括mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1基因组的5’端和3’端utr序列、复制酶基因orf1a、orf1b基因和核衣壳蛋白n基因，以及新霉素磷酸转移酶neo基因和nanoluc荧光素酶报告基因，上述基因被插入在cmv真核启动子、hdv核酶和bgh终止信号的pbelobac11载体上；其中，mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒序列如seq id no：1所示。
2.权利要求1所述的mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒的构建方法，其特征在于：将mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1病毒基因组5’端utr区域和orf1a/orf1b基因的序列分割成6个连续的片段a-f；
3.一种mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子细胞系的构建方法，其特征在于：通过利用脂质体转染试剂，将mers簇穿山甲冠状病毒mjhku4r cov-1复制子质粒转染至bhk21细胞，然后在0.5mg/ml新霉素g418的条件选择环...
【专利技术属性】
技术研发人员：石正丽，吴春光，陈静，朱燕，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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