【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其应用，所述应用包括检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、肺结节，即孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule)是指影像为类圆形阴影、单一的、边界清楚的、直径小于或等于3cm、周围为含气肺组织所包绕的高低密度的实性或者亚实性病变，不伴肺不张、肺门肿大或胸腔积液。其常侵犯肺、双侧肺门淋巴结、眼、皮肤等器官，其胸部受侵率高达80％～90％。相当多的肺结节不能排除早期恶性肿瘤的可能性。肺结节是原发性肺癌的一个重要指标
2、肺结节通常分为良性和恶性两类，但不管是良性还是恶性都常无明显症状，良性结节需要针对病因治疗，恶性需要早期手术。良性肺结节的病因常与自身性免疫疾病或各种感染相关，恶性肺结节的病因常与肺癌相关。
3、肺癌的临床表现比较复杂，症状和体征的有无、轻重以及出现的早晚，取决于肿瘤发生部位、病理类型、有无转移及有无并发症，以及患者的反应程度和耐受性的差异。肺癌早期症状常较轻微，甚至可无任何不适。中央型肺癌症状出现早且重，周围型肺癌症状出现晚且较轻，甚至无症状。因此，一旦出现临床症状或者常规检测时被发现，就到了肺癌的晚期。因此，早期筛查显得至关重要。肺癌早期一般表现为肺部恶性肺结节，因此，早期筛查一般从肺结节的检测入手。
4、在取材方面，相对于组织活检，液体活检具有操作简便、非侵入性、重复性强和利于疾病的动态监测等优势。肺癌液体活检以患者的血液、痰液和肺泡灌洗液等为标本，对其中的肿瘤细胞dna及其修饰水平，如
5、本申请的申请人和专利技术人在早先的研究中，一直在筛选能很好实现检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，在逐步加深的研究中，进一步寻找一些能很好地适用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或者其组合，以期能实现能能高灵敏度和特异性对肺结节良恶性的检测，特别是还能针对呼吸道液体样本实现加高灵敏度检测，从而为肺癌特别是早期肺癌的无创诊断提供技术支持。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的之一是提供一种用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，所述dna甲基化分子标记物组合对肺结节良恶性的检测具有非常好的灵敏度和特异性，能有效提高恶性肺结节的检出率。
2、实现上述目的的技术方案包括以下。
3、本专利技术的第一方面，提供了一种可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物。
4、一种可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，所述dna甲基化分子标记物包括seq id no.6或其完全互补序列，或seq id no.6或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段。
5、本专利技术的第二方面，提供了所述dna甲基化分子标记物和/或检测其甲基化水平的试剂在制备检测肺结节良恶性、和/或肺癌的试剂盒中的应用。
6、本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述的dna甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。
7、本专利技术的第四方面，提供了上述dna甲基化分子标记物组合的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
8、(1)从待测样本中提取基因组dna；
9、(2)对提取获得的基因组dna进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的dna；
10、(3)步骤(2)获得转化产物用针对上述dna甲基化分子标记物的探针进行多重荧光定量pcr检测。
11、本专利技术的第五方面，还提供了一种检测肺结节良恶性的方法，包括以下步骤：
12、(1)从待测样本中提取基因组dna；
13、(2)对提取获得的基因组dna进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的dna；
14、(3)用上述试剂盒进行检测；或还包括
15、(4)通过内参基因ct值判断样本是否有效，然后用内参基因ct值对有效样本中检测的每个分子标记物的ct值进行校正；
16、(5)将校正后的数据进行模型分析，最后进行肺结节良恶性的判断。
17、本专利技术找到了与肺结节良恶性高度相关的dna甲基化特异性的特定的分子标记物的组合，通过检测这些标记物的甲基化水平可以更好地检测肺结节良恶性，具有更高的灵敏度和特异性，提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，能有效提高早期恶性肺结节的检出率，及早进行治疗和干预，提高患者生存率；同时降低检出的假阳性率，避免良性肺结节的过度诊疗。本专利技术提供的优选的dna甲基化分子标记物组合与肺结节良恶性高度相关、尤其适用于呼吸道样本，包括通过微创或无创手段获取的呼吸道液体样本，可以实现肺结节无创检测。
18、本专利技术设计的所述dna甲基化分子标记物的荧光定量pcr检测引物和探针，通过引物对经过亚硫酸氢盐处理的dna，后续对转化产物进行多重荧光定量pcr检测，所述试剂盒经过优化，针对不同dna甲基化分子标记物的引物和探针相互之间没有干扰，可成功实现多重荧光定量pcr检测，有效提高检测效率。
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1.一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.6或其完全互补序列，或SEQ ID NO.6或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段。
2.根据权利要求1所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，还包括选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列中的至少一种；或选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.4，或包括SEQ ID NO.6和SEQID NO.4的完全互补序列。
4.根据权利要求3所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物还包括SEQ ID NO.2或其完全互补序列；
5.根据权利要求1或3所述的可用于检测肺结节良恶性
6.根据权利要求5所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，还包括SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3，或其完全互补序列；
7.根据权利要求5所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，还包括SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3，或其完全互补序列；
8.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.1所示序列或其完全互补序列；或
9.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4，或包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的完全互补序列；
10.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5，或包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQID NO.5的完全互补序列；
11.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6，或包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的完全互补序列；
12.一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列或其完全互补序列；或
13.根据权利要求1-12任一所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，
14.根据权利要求13所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，
15.根据权利要求1至14所述的可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物为针对呼吸道样本的分子标记物，优选为肺部组织样本，或呼吸道液体样本。
16.权利要求1至15任一项所述DNA甲基化分子标记物和/或检测其甲基化水平的试剂在制备检测肺结节良恶性、和/或肺癌的试剂盒中的应用。
17.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1～13任一项所述的DNA甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。
18.根据权利要求17所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采用PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、代测序法、三代测序法二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。
19.根据权利要求18所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光...
【技术特征摘要】
1.一种可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物包括seq id no.6或其完全互补序列，或seq id no.6或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段。
2.根据权利要求1所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，还包括选自seq id no.1～seq id no.5所示序列或其完全互补序列中的至少一种；或选自seq id no.1～seq id no.5所示序列或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物包括seq id no.6和seq id no.4，或包括seq id no.6和seqid no.4的完全互补序列。
4.根据权利要求3所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物还包括seq id no.2或其完全互补序列；
5.根据权利要求1或3所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物还包括seq id no.5或其完全互补序列；
6.根据权利要求5所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，还包括seq id no.2和/或seq id no.3，或其完全互补序列；
7.根据权利要求5所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，还包括seq id no.1和/或seq id no.3，或其完全互补序列；
8.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物包括seq id no.6和seq id no.1所示序列或其完全互补序列；或
9.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物包括seq id no.6、seq id no.1、seq id no.2、seq idno.3和seq id no.4，或包括seq id no.6、seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq idno.4的完全互补序列；
10.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物包括seq id no.6、seq id no.1、seq id no.3、seq idno.4和seq id no.5，或包括seq id no.6、seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4和s...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶竹佳，杨昊，刘艳英，陶锦胜，罗茜，许洁涵，陈志伟，范建兵，
申请(专利权)人：广州市基准医疗有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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