【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞治疗、肿瘤防治、自身免疫病防治、疫苗开发，具体涉及一种功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法及其应用。
技术介绍
1、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pdc)作为一类特别的树突状细胞亚群，在接受抗原等刺激活化之后，可以大量产生i型干扰素，从而在i型干扰素相关的自身免疫病(比如干燥综合征、系统性红斑狼疮等)发病的过程中起关键的致病作用。而在肿瘤中，耐受状态的浆细胞样树突状细胞又会促进肿瘤的进展(immunity.2019jan 15；50(1):37-50.doi:10.1016/j.immuni.2018.12.027.)。pdc作为一种可以大量产生i型干扰素和具有抗原递呈能力的树突状细胞亚群，如果能有效利用其特性，可以对肿瘤等疾病提供新的治疗手段。例如，可以利用活化的pdc来制备dc疫苗，回输到病人体内进行抗肿瘤治疗；也可以利用活化的pdc来治疗病毒感染病人。
2、截止目前，小鼠的pdc诱导技术很成熟，但是人的pdc则缺乏好的诱导方法。由于无法体外大量获得pdc，阻止了该细胞亚群在抗肿瘤等细胞治疗领域的应用。因此，我们开发人的pdc的体外大规模诱导方法，并优化诱导流程，为pdc未来应用于肿瘤和其它疾病领域的治疗提供基础。
3、根据已有的报道，人的pdc诱导目前是从脐血干细胞诱导分化，利用三种细胞因子scf、tpo和flt3l组合来进行。但是有明显不足：①诱导效率低下，只能有小于4％的诱导效率；②获得数目极少。从脐血干细胞到最终的pdc，只
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法及其应用。通过采用新的诱导方法，可以体外获得大量的功能增强的pdc，从而为未来基于pdc的细胞疗法奠定基础。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，包括以下步骤：
4、a、将人的脐血干细胞铺板，采用添加了细胞因子的基础培养基进行培养；
5、b、将步骤a培养后得到的cbpdc细胞收集后，加入添加了还原剂的基础培养基中，然后加入激动剂刺激cbpdc细胞，培养后即得功能增强型浆细胞样树突状细胞。
6、作为优选方案，步骤a中，所述脐血干细胞为cd34+的脐血干细胞，通过将人的脐带血进行离心和分离后得到。
7、作为优选方案，所述离心具体采用密度梯度离心方法，从而获得单个核细胞；所述分离具体采用cd34阳选kit(miltenyi biotec)单个核细胞进行分离得到所需的cd34+的脐血干细胞。
8、作为优选方案，所述添加了细胞因子的基础培养基中，细胞因子包括scf细胞因子、flt3l细胞因子、tpo细胞因子、il3细胞因子、ifn-γ细胞因子和ifn-β细胞因子；本专利技术通过在基础培养基加入scf+flt3l+tpo+il3+ifn-γ+ifn-β的细胞因子优化组合，可以诱导调控pdc分化的关键转录因子tcf4的表达，从而高效得到pdc细胞亚群；
9、所述基础培养基为sfemii。
10、作为优选方案，各所述细胞因子的添加浓度分别为：10-200ng/ml scf细胞因子、10-200ng/ml flt3l细胞因子、10-200ng/ml tpo细胞因子、10-200ng/ml il3细胞因子、2-20ng/ml ifn-γ细胞因子和2-20ng/ml ifn-β细胞因子。更优选各所述细胞因子的添加浓度分别为：100ng/ml scf细胞因子、100ng/ml flt3l细胞因子、100ng/ml tpo细胞因子、20ng/ml il3细胞因子、5ng/ml ifn-γ细胞因子和5ng/ml ifn-β细胞因子。
11、作为进一步的优选方案，所述细胞因子为人源细胞因子，具体为人的scf细胞因子、人的flt3l细胞因子、人的tpo细胞因子、人的il3细胞因子、人的ifn-γ细胞因子和人的ifn-β细胞因子。
12、作为优选方案，步骤a中，所述培养条件为：在温度为温度为37℃，5％ co2条件下培养14天。
13、作为优选方案，步骤b中，所述添加了还原剂的基础培养基中，还原剂选自nac、fer1中的至少一种；本专利技术通过特定添加nac、fer1还原剂可以拮抗pdc激活过程中的氧化损伤，从而促进了pdc i型干扰素的产生，而其它还原剂(如谷胱甘肽)则没有这种效果；
14、所述基础培养基为sfemii；
15、所述培养条件为：在温度为37℃，5％ co2条件下培养过夜。
16、作为优选方案，所述还原剂的添加浓度为1-500μm，更优选还原剂的添加浓度为1-200μm。
17、作为优选方案，所述还原剂为fer1时，其添加浓度为1-50μm；所述还原剂为nac时，其添加浓度为50-200μm。
18、作为优选方案，所述激动剂为tlr7/8激动剂，激动剂的添加浓度为1-20ug/ml。更优选激动剂的添加浓度为10ug/ml。
19、作为优选方案，步骤a中，所述脐血干细胞进行铺板的密度为每孔1-20×105/ml，更优选脐血干细胞进行铺板的密度为每孔5×105/ml；
20、步骤b中，所述cbpdc细胞进行培养的密度为1-20×105/ml，更优选cbpdc细胞进行培养的密度为1×106/ml。
21、第二方面，本专利技术提供了一种根据前述体外诱导方法获得的功能增强型浆细胞样树突细胞在制备预防和治疗肿瘤的药物中的应用。
22、作为优选方案，所述预防肿瘤的药物包括疫苗。
23、作为优选方案，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑癌、头颈癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头或颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、威尔曼瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、生殖泌尿癌、甲状腺癌、食管癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、绒毛膜癌、蕈样肉芽肿病、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、毛细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波西氏肉瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、成骨性肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤等。
24、与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
25、1)本专利技术采用最优化的细胞因子组合：scf+flt3l+tpo+ifn-γ+ifn-β来大量获得pdc，极大的提高了pdc的诱导本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，步骤A中，所述脐血干细胞为CD34+的脐血干细胞，通过将人的脐带血进行离心和分离后得到。
3.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，所述添加了细胞因子的基础培养基中，细胞因子包括SCF细胞因子、Flt3L细胞因子、TPO细胞因子、IL3细胞因子、IFN-γ细胞因子和IFN-β细胞因子；
4.根据权利要求3所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，各所述细胞因子的添加浓度分别为：10-200ng/ml SCF细胞因子、10-200ng/ml Flt3L细胞因子、10-200ng/ml TPO细胞因子、10-200ng/ml IL3细胞因子、2-20ng/ml IFN-γ细胞因子和2-20ng/ml IFN-β细胞因子。
5.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，步骤A中，所述培养条件
6.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，步骤B中，所述添加了还原剂的基础培养基中，还原剂选自NAC、Fer1中的至少一种；
7.根据权利要求6所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，所述还原剂的添加浓度为20-500μM。
8.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，所述激动剂为TLR7/8激动剂，激动剂的添加浓度为1-20ug/ml。
9.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，步骤A中，所述脐血干细胞进行铺板的密度为每孔1-20×105/ml；
10.一种根据权利要求1-9任一项所述体外诱导方法获得的功能增强型浆细胞样树突细胞在制备预防和治疗肿瘤的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，步骤a中，所述脐血干细胞为cd34+的脐血干细胞，通过将人的脐带血进行离心和分离后得到。
3.根据权利要求1所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，所述添加了细胞因子的基础培养基中，细胞因子包括scf细胞因子、flt3l细胞因子、tpo细胞因子、il3细胞因子、ifn-γ细胞因子和ifn-β细胞因子；
4.根据权利要求3所述的功能增强型浆细胞样树突状细胞的体外诱导方法，其特征在于，各所述细胞因子的添加浓度分别为：10-200ng/ml scf细胞因子、10-200ng/ml flt3l细胞因子、10-200ng/ml tpo细胞因子、10-200ng/ml il3细胞因子、2-20ng/ml ifn-γ细胞因子和2-20ng/ml ifn-β细胞因子。
5.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：周海波，沈南，刘灿，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：
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