【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫细胞，尤其涉及一种注射用人自体血增强型自然杀伤细胞的培养体系和培养方法。
技术介绍
1、自然杀伤细胞(natural killer cell,nk细胞)是一类特殊的淋巴细胞，对先天性免疫系统和适应性免疫系统均有重要作用。nk细胞无需特定的抗原预先致敏即可激活，并通过诱导一系列的免疫反应杀伤靶细胞，包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞、衰老细胞等。
2、nk细胞治疗属于过继细胞免疫疗法，nk细胞杀伤肿瘤细胞的机制多种多样，通常包括直接的细胞毒作用、抗体依赖的细胞介导细胞毒作用(adcc)、分泌多种效应细胞因子等。由于nk细胞杀伤作用具有非mhc限制性的，即不受肿瘤组织类型的限制，因此对任何一种肿瘤均有杀伤作用，如黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、胆囊癌和胰腺癌等具有较好的疗效。nk细胞治疗适用于任何一期的癌症患者，对早期肿瘤患者或经过手术及放化疗后肿瘤负荷较小的患者效果好。它对于手术、放化疗或造血干细胞移植后患者体内微小残留病灶的清除，防止癌细胞扩散和复发，提高患者自身免疫力，减少毒性反应等方面具有重要作用。某些不适合手术、不能耐受放化疗的中晚期肿瘤患者，nk细胞治疗可以提高其生活质量，延长带瘤生存时间。近些年，由于肿瘤免疫治疗研究的深入，以及免疫治疗在克服传统肿瘤治疗中化疗和放疗毒副作用和耐药性的特性，nk细胞在抗肿瘤免疫治疗中的地位也越来越受到重视。
3、有研究表明肿瘤患者外周血nk细胞的活性与其痊愈后存在着密切关系，然而，nk细胞仅占外周血淋巴细胞的5-10％，且目前
4、因此，亟需开发一种安全、大规模体外培养nk细胞的方法，增强其扩增效率及抗肿瘤功能。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提出了一种注射用人自体血增强型自然杀伤细胞的培养体系和培养方法，以克服目前自然杀伤细胞扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低的问题。所述的自然杀伤细胞通过自体外周血单个核细胞分离、自然杀伤细胞活化和增殖步骤制备得到，具有细胞扩增效率高，纯度高、抗肿瘤能力好，制备方法简单安全，成本低的特点。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种注射用人自体血增强型自然杀伤细胞的培养体系，包括包被溶液、活化溶液、活化基础培养基、活化完全培养基和增殖完全培养基；
3、所述包被溶液含有cd3单克隆抗体和cd272单克隆抗体；
4、所述活化溶液含有il-2、il-18、il-12、il-7和il-1α；
5、所述活化基础培养基含有人血白蛋白和重组转铁蛋白；
6、所述活化完全培养基由活化基础培养基、自体灭活血浆和活化溶液组成；
7、所述增殖完全培养基含有il-2、人血白蛋白、重组转铁蛋白和l-谷氨酰胺。
8、优选的，包被溶液中所述cd3单克隆抗体的浓度为50～500μg/ml，所述cd272单克隆抗体的浓度为100～1000μg/ml。
9、优选的，活化溶液中所述il-2的浓度为10～200iu/ml，所述il-18的浓度为10～200iu/ml，所述il-12的浓度为10～200iu/ml，所述il-7的浓度为1～100iu/ml，所述il-1α的浓度为1～100iu/ml。
10、优选的，活化基础培养基中所述人血白蛋白的浓度为10g/ml，所述重组转铁蛋白的浓度为8g/ml；活化完全培养基按照体积比，由94.5％所述活化基础培养基、5％自体灭活血浆和0.5％所述活化溶液组成。
11、优选的，增殖完全培养基中所述il-2的浓度为1000iu/ml，所述人血白蛋白的浓度为15g/ml，所述重组转铁蛋白的浓度为3g/ml，所述l-谷氨酰胺的浓度为0.5g/ml。
12、优选的，所述包被溶液以pbs为基础溶液，还含有肝素钠，所述肝素钠的浓度为1000iu/ml；
13、所述活化溶液以pbs为基础溶液；
14、所述活化基础培养基以无血清培养基为空白培养基配制所得，还含有维生素b和胰岛素，所述维生素b的浓度为0.5～1mg/ml，所述胰岛素的浓度为3～10μg/ml；
15、所述增殖完全培养基以无血清培养基为空白培养基配制所得，还含有维生素b、右旋糖酐和胰岛素，所述维生素b的浓度为0.5～1mg/ml，所述右旋糖酐的浓度为0.2～0.5g/ml，所述胰岛素的浓度为3～10μg/ml。
16、本专利技术还提供了利用所述的培养体系培养注射用人自体血增强型自然杀伤细胞的方法，包括以下步骤：
17、分离自体外周血中的单个核细胞，包被溶液包被处理培养器皿；将所述单个核细胞和活化完全培养基放入所述培养器皿中活化培养，得活化细胞；所述活化细胞在增殖完全培养基中扩增培养，重悬并与人血白蛋白混合，即得自然杀伤细胞。
18、优选的，所述单个核细胞与活化完全培养基的比例为1.0×106～1.5×106cells：1ml。
19、优选的，所述活化细胞密度维持在0.8×106～1.5×106cells/ml。
20、本专利技术还提供了所述的培养自然杀伤细胞的方法培养所得自然杀伤细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
21、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和技术效果：
22、本专利技术所述的自然杀伤细胞(nk细胞)培养体系和培养方法，适用于注射用人自体血增强型nk细胞临床级生产。利用所述的nk细胞培养体系制备nk细胞制剂，无需添加外源动物血清，也无需采用外源滋养层细胞，制备方法更安全，操作简单。
23、本专利技术所述的nk细胞培养体系和培养方法，克服目前nk细胞扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低的问题。肿瘤患者的nk细胞在外周血中含量较低，且基本处于抑制状态，本专利技术所述的nk细胞培养体系能够更大程度地解除nk细胞抑制，激活nk细胞，提升其肿瘤杀伤活性。本专利技术所述的nk细胞培养体系和培养方法更适用于培养用于肿瘤病人治疗的nk细胞。
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1.一种注射用人自体血增强型自然杀伤细胞的培养体系，其特征在于：包括包被溶液、活化溶液、活化基础培养基、活化完全培养基和增殖完全培养基；
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：包被溶液中所述CD3单克隆抗体的浓度为50～500μg/mL，所述CD272单克隆抗体的浓度为100～1000μg/mL。
3.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：活化溶液中所述IL-2的浓度为10～200IU/mL，所述IL-18的浓度为10～200IU/mL，所述IL-12的浓度为10～200IU/mL，所述IL-7的浓度为1～100IU/mL，所述IL-1α的浓度为1～100IU/mL。
4.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：活化基础培养基中所述人血白蛋白的浓度为10g/mL，所述重组转铁蛋白的浓度为8g/mL；活化完全培养基按照体积比，由94.5％所述活化基础培养基、5％自体灭活血浆和0.5％所述活化溶液组成。
5.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：增殖完全培养基中所述IL-2的浓度为1000IU/mL，所述人血白蛋白的浓
6.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：所述包被溶液以PBS为基础溶液，还含有肝素钠，所述肝素钠的浓度为1000IU/mL；
7.利用权利要求1～6任一项所述的培养体系培养注射用人自体血增强型自然杀伤细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述培养自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述单个核细胞与活化完全培养基的比例为1.0×106～1.5×106cells：1mL。
9.根据权利要求7所述培养自然杀伤细胞的方法，其特征在于：所述活化细胞密度维持在0.8×106～1.5×106cells/mL。
10.权利要求7～9任一项所述的培养自然杀伤细胞的方法培养所得自然杀伤细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种注射用人自体血增强型自然杀伤细胞的培养体系，其特征在于：包括包被溶液、活化溶液、活化基础培养基、活化完全培养基和增殖完全培养基；
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：包被溶液中所述cd3单克隆抗体的浓度为50～500μg/ml，所述cd272单克隆抗体的浓度为100～1000μg/ml。
3.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：活化溶液中所述il-2的浓度为10～200iu/ml，所述il-18的浓度为10～200iu/ml，所述il-12的浓度为10～200iu/ml，所述il-7的浓度为1～100iu/ml，所述il-1α的浓度为1～100iu/ml。
4.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于：活化基础培养基中所述人血白蛋白的浓度为10g/ml，所述重组转铁蛋白的浓度为8g/ml；活化完全培养基按照体积比，由94.5％所述活化基础培养基、5％自体灭活血浆和0.5％所述活化溶液组成。
5.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄红日，叶光耀，王辉煌，
申请(专利权)人：广西泰美人生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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